[CONSIGLI] [GuIda rapIda per L`avvIameNtO deL SIStema

[Guida rapida per l’avviamento del sistema ACQUITY UPLC]
Il sistema ACQUITY UPLC vi consente di sfruttare pienamente le enormi
potenzialità delle colonne LC con fase stazionaria a granulometria
inferiore ai 2 μm.
La tecnologia Waters® UltraPerformance LC® (UPLC®) si basa sui medesimi principi e suegue le stesse regole della
cromatografia convenzionale, ma vanta una innovativa progettazione degli strumenti specificamente studiata per ridurre
al minimo i volumi morti del sistema. Per trarre il massimo vantaggio dalle fasi stazionarie con granulometria inferiori
ai 2 μm, il sistema ACQUITY UPLC® necessita di flussi più elevati (per operare nella regione corretta della curva di
van Deemter) e di alcune semplici considerazioni nel trasferimento nell’ottimizzazione dei metodi. Seguendo questi
pochi, elementari suggerimenti, apprenderete come trarre il massimo vantaggio dal vostro sistema e ottenere risultati
cromatografici straordinari.
CONSIGLI GENERALI SULL E CONDIZIONI DI UT ILIZZO DI U P LC
Flussi operativi
Per le colonne con diametro interno di 2,1 mm, i corretti flussi operativi sono, di norma, 0,60 mL/min per le molecole di piccole dimensioni e 0,1 mL/min
per i composti ad alto peso molecolare come peptidi e proteine.
[CONSIGLI]
Durata dei gradienti generici per molecole di piccole dimensioni
N. di analiti
Lunghezza colonna
(mm)
Flusso (mL/min)
Tempo gradiente
(min)
da 1 a 3
30
1,20
1
da 3 a 10
50
1,00
5
da 10 a 25
100
0,60
10
> 25
150
0,40
25
Vi occorre una maggiore risoluzione? Aumentate la
lunghezza della colonna.
Vi occorre una maggiore velocità? Aumentate il
flusso.
Velocità lineare UPLC a flussi diversi con le colonne da 2,1 mm di diametro interno (D.I.)
Colonne 2,1 mm D.I. (40 °C)
Velocità lineare UPLC
(mm/sec)
Dimensioni colonna
(mm)
3
Flusso
(mL/min)
4
Contropressione
(psi)
Flusso
(mL/min)
5
Contropressione
(psi)
Flusso
(mL/min)
6
Contropressione
(psi)
Flusso
(mL/min)
Contropressione
(psi)
2,1 x 30
0,45
3000
0,60
4100
0,75
5100
0,90
6100
2,1 x 50
0,45
4800
0,60
6400
0,75
8000
0,90
9500
2,1 x 100
0,45
9100
0,60
12.100
0,75
15.200
0,90
18.200
2,1 x 150
0,45
13.400
0,60
17.900
0,75
22.400
0,90
26.900
N.B.: A) Colonne a fase inversa ACQUITY UPLC BEH C18 con particelle da 1,7 μm
B) CH3CN/gradiente acquoso, Pmax a ~30% ACN
C) Contropressione massima approssimativa fornita dall’intero sistema
Per maggiori informazioni su ACQUITY UPLC e per ricevere
una copia di questa scheda, si prega di visitare il sito Internet:
Comunità online ACQUITY UPLC®
Apprendete, condividete e migliorate
i vostri risultati!
[Guida rapida per l’avviamento del sistema ACQUITY UPLC]
CONSIGLI P ER IL T RASF E RIMENTO E L’OT T IMIZZAZIONE METODI DA H P LC A U P LC
Procedura guidata
1. Raccogliere informazioni in merito al metodo
HPLC utilizzato
Utilizzare esattamente la stessa fase mobile:
n Tampone
n pH
n Forza ionica
n Solvente organico
n Composizione in percentuale
2. Confrontare gli strumenti
3. Selezionare la corretta colonna UPLC
Fase stazionaria: consultare il Grafico della
selettività delle fasi stazionarie.
Dimensioni: calcolare per la colonna il rapporto lunghezza della colonna/diametro delle
particelle (L/dp) e selezionare la lunghezza della
colonna UPLC adatta:
Se l’obiettivo principale è:
Altissima velocità
30 mm di lunghezza per iniziare (L/dp =17.770)
Velocità e risoluzione
50 mm di lunghezza per iniziare (L/dp =29.500)
Risoluzione e velocità
100 mm di lunghezza per iniziare (L/dp =58.900)
Altissima risoluzione
150 mm di lunghezza per iniziare (L/dp =88.300)
Osservare e confrontare il volume morto ed il
ritardo del gradiente.
4. Selezionare le condizioni UPLC sulla base delle considerazioni geometriche
5. Ottimizzare il flusso alle condizioni UPLC
Volume di iniezione:
n Volume di iniezione UPLC = volume di iniezione HPLC x (volume colonna UPLC /volume colonna HPLC)
Le velocità di flusso ottimali sono superiori
per colonne con granulometria 1,7 μm.
n Flusso: i metodi isocratici necessitano solamente di una regolazione del flusso e del volume di iniezione
n Flusso UPLC: Flusso HPLC x (π x r2 della colonna UPLC / π x r2 della colonna HPLC)
Utilizzando flussi superiori a quelli
ottimaliLa perdita di efficienza è minima .
Profilo del gradiente:
n Calcolare per ogni segmento del gradiente il volume di eluente pompato in colonna
n Esprimere il volume calcolato in volumi di colonna (Volume pompato/ volume della colonna)
n Calcolare il tempo necessario per fornire lo stesso numero di volumi colonna alla colonna UPLC alla
velocità di flusso geometricamente scalata
n Considerando il flusso UPLC, Calcolare il tempo necessario per fornire alla colonna UPLC lo stesso numero
CONSIGLIO: per agevolare il trasferimento metodi
da HPLC ad UPLC, Waters ha progettato “ACQUITY
UPLC Columns Calculator”.: un semplice calcolatore
che offre tre diverse opzioni di trasferimento: pari
efficienza, massima efficienza e tempo di analisi più
breve.
di volumi colonna
LINEE GUIDA O P ERAT IV E SU P P L EMENTA RI
Solvente per lavaggio Sistema di gestione campioni
per cromatografia in fase inversa
Weak needle wash Modalità Loop totale Modalità Loop parziale (a pressione)
Modalità Loop parziale –
sovrariempimento ago
Condizioni iniziali
gradiente
Condizioni iniziali
gradiente
1:1 metanolo o
1:1 acqua
Strong needle wash Tutte le modalità di iniezione
70:20:10
metanolo/acqua/IPA
Pari quantità di metanolo, acetonitrile, acqua, IPA più lo 0,1% di acido formico.
In tutti i casi, i solventi di lavaggio dovrebbero essere compatibili con il
campione ed solvente in cui è preparato.
Preparazione dei campioni
Preparare i campioni utilizzando uno dei seguenti metodi:
n Estrazione in fase solida (cartucce Oasis ® o Sep-Pak ®) per
eliminare le impurezze prima dell’analisi che contribuiscono
spesso alla contaminazione delle colonne.
n La piastra di precipitazione delle proteine (piastre Sirocco™)
produce un estratto più puro in UV e MS rispetto alla
centrifugazione o a tanti altri metodi, e inoltre contribuisce alla
rimozione del particolato.
n Centrifugazione (20 minuti a 8000 rpm) con un attento
trasferimento del liquido surnatante.
Filtrare i campioni mediante un filtro da 0,2 μm compatibile per
rimuovere il particolato.
Ove possibile, sciogliere i campione nella fase mobile iniziale (o più
debole, ossia con un a minore quantità di solvente organico).
Per assicurare la purezza ed evitare i picchi fantasma, utilizzare i vial
certificati LC/MS Waters.
[Guida rapida per l’avviamento del sistema ACQUITY UPLC]
[CONSIGLI]
Equilibrazione delle colonne
Ad esempio:
Equilibrare un adeguato numero di volumi colonna (solitamente cinque).
Colonna: 2,1 x 50 mm; 1,7 μm con flusso di 0,8 mL/min
Volume colonna = ∏ x r2l = ∏ (0,105 cm)2 x (5 cm) = 0,173 mL
Volume sistema = 0,080 mL
Equilibrazione del sistema
Durata di equilibrazione sistema:
= (5 volumi colonna + 3 volumi sistema)/ flusso
= (0,865 mL + 0,240)/(0,80 mL/min)
= 1,4 min
In generale, per ricondizionare il sistema dopo un’analisi in
gradiente è necessario, in totale, tre volte il volume del sistema e
cinque volte il volume della colonna.
Componenti del sistema ACQUITY UPLC
Sistema binario di gestione degli
eluenti (BSM)
Sistema di gestione dei campioni
Rivelatori
Utilizzare solventi, tamponi e additivi di
massima qualità, nonché acqua purissima Rimanere entro i limiti consigliati per ciascuna modalità Assicurare sempre che il regolatore della contropressione sia installato
(priva di particelle, chimicamente pura,
di iniezione e dimensioni del loop.
se il rivelatore UV è l’ultimo prima dello scarico.
18 megaohm/cm di conducibilità).
Monitorare il livello degli scarichi.
Utilizzare la modalità “Full Loop” quando massima
precisione e accuratezza sono cruciali.
Rimuovere il regolatore della contropressione dal TUV o dal PDA se un
MS (o un secondo rivelatore) è l’ultimo della fila.
Filtrare i tamponi (si consiglia una
membrana filtrante di 0,2 μm).
Utilizzare la modalità “Partial Loop pressure assisted”
quando la quantità di campione disponibile è limitata.
Scegliere una velocità di campionamento del segnale 25 a 50 punti
sul picco.
Non bloccare la linea di sfiato del
degassatore.
Utilizzare la modalità di iniezione “Partial Loop – con
“Needle Overfill” quando si richiede la migliore
accuratezza, precisione e linearità del loop parziale per
un’ampia gamma di campioni.
Scegliere la costante iniziale del filtro digitale in base ai requisiti del
metodo. Se la sensibilità rappresenta il fattore più importante, iniziare
con FAST. Se la velocità rappresenta il fattore più importante, iniziare
con NORMAL.
Mantenere cariche tutte le quattro linee Caratterizzare i volumi dell’ago e del loop quando si
di solvente (per mantenere il degassatore sostituiscono i solventi per lavaggio delicato nonché i
in efficienza).
loop e gli aghi.
Ottimizzare le costanti del filtro digitale una volta che il metodo è
stato sviluppato, per compensare sensibilità e risoluzione.
Mantenere carico il lavaggio delle
guarnizioni (per aumentare la vita utile
delle guarnizioni BSM).
Utilizzare sempre il tubo stabilizzatore della colonna,
anche se non si utilizza la temperatura.
Ricaricare le linee di solvente prima di
iniziare (utilizzare System Prep o System
Start-up).
Utilizzare Load Ahead quando sono necessarie durate più
lunghe dei cicli.
Iniziare i gradienti con una con una
piccola percentuale, 0,1%, di sovente
organico (producendo così una
formazione del gradiente più coerente
e prevedibile rispetto alla completa
assenza di solvente organico).
Modalità di iniezione del sistema ACQUIT Y UPLC***
Volume di iniezione campione (µL)
Partial Loop
Volume loop (µL)
1
2
5
10
20
50**
Needle Overfill
Intervallo di iniezione (µL) da 0,20 a 0,75 da 0,40 a 0,150 da 1,00 a 3,80
da 2,00 a 7,50 da 4,00 a 15,00 da 10,00 a 37,50
Pressure Assist*
Intervallo di iniezione (µL) N.R.
Full Loop Pressure Assist (fattore
di sovrariempimento predefinito
dall’utente)****
1
N.R.
N.R.
da 2,00 a 5,00 da 4,00 a 10,00 da 10,00 a 25,00
2
5
10
20
50**
N.C. = Non consigliato
* Modalità “Partial Loop”: dovrebbe essere riservata a quelle situazioni in cui la durata dell’analisi ha la precedenza su qualsiasi altro fattore, in cui il volume è
molto limitato o in cui il volume di iniezione è molto esteso.
** Va utilizzata con una siringa di misurazione da 250 μL.
*** La precisione/il recupero relativi al design dell’iniettore loop fisso in modalità Loop parziale dipende dai parametri avanzati di iniezione.
**** Percentuale area RSD < 1,0 per la modalità sia Parziale che PLNO
Percentuale area RSD < 0,3% per la modalità Loop totale
[Guida rapida per l’avviamento del sistema ACQUITY UPLC]
Funzione Prep del sistema ACQUIT Y UPLC
Dalla console del sistema ACQUITY UPLC selezionare Start-up
dal menu a tendina principale e completare ogni scheda; una volta
terminate le impostazioni, fare clic su Start.
Funzione “System Start-up”: tutte le operazioni necessarie per trattare il sistema riunite in un’unica funzione:
n Caricare/spurgare tutte le pompe e le linee solvente
n Caricare/spurgare tutte le siringhe
n Equilibrare il sistema e le fasi stazionarie con parametri operativi
corretti (solvente, flusso, temperatura)
n Dalla console o compreso nel set campioni del software Empower™,
oppure fare clic con il tasto destro per analizzare i campioni
Funzione di ricondizionamento del sistema “System Prep”:
n Caricare i solventi A1 e B1 (2 min)
n Caricare tutte le siringhe una volta
Start-up del sistema ACQUITY UPLC.
Completare ogni scheda della console del
sistema ACQUITY UPLC, quindi fare clic su Start.
[STRUMENTI]
Registratevi alla “e-Community ACQUITY UPLC” su www.waters.com/myuplc per richiedere risorse e strumenti che vi
aiutino ad ottenere il massimo da UltraPerformance.
n
ACQUITY UPLC Columns Calculator: automatizza i calcoli necessari per il trasferimento metodi da HPLC sia isocratici sia in gradiente a metodi UPLC
Grafico per la selettività delle colonne in fase inversa Waters: per selezionare interattivamente le colonne da utilizzare nello sviluppo metodi, scegliere le colonne in base al fornitore o al tipo di ligando, e trovare rapidamente fasi stazionarie per colonne equivalenti per i metodi esistenti
n
n
Scheda di consultazione rapida del sistema ACQUITY UPLC: procedure di avviamento quotidiano del sistema
n
Consigli, domande frequenti e forum per utenti: argomenti proposti dagli utenti, domande frequenti e discussioni scientifiche
n
Note applicative e poster
n
Presentazioni di esperti e filmati
...ed altro ancora.
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