Lezione 12: Cromatografia su colonna

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Metodologia Biochimica 2002 – Lez. 4
CROMATOGRAFIA SU COLONNA
La cromatografia è una tecnica di migrazione differenziata che permette la separazione
dei costituenti di una miscela di sostanze affini. La cromatografia può essere di tipo
analitico o preparativo.
In ogni tecnica cromatografica devono essere identificabili due fasi immiscibili tra loro: una
fase stazionaria, che può essere solida o liquida, e una fase mobile che può essere
liquida o gassosa, e che contiene la miscela di sostanze da separare. Di fatto, nel caso di
cromatografia per la separazione di proteine si impiega sempre una cromatografia su
colonna, dove la fase stazionaria è immobilizzata su un supporto (matrice) inerte ed
insolubile, ‘impaccato’ dentro una colonna di vetro, plastica o metallo.
Nella cromatografia su colonna, la miscela da separare, caricata sulla cima della colonna,
viene trascinata all’interno della matrice da una aggiunta continua di solvente (fase
mobile). Durante il percorso, le varie componenti della miscela sono rallentate in misura
variabile e quindi tendono a separarsi. Le varie componenti usciranno a tempi diversi dalla
colonna, e saranno raccolte in frazioni diverse di eluato.
Caricamento
campione
Flusso di solvente,
separazione componenti Colonna
contenente la fase stazionaria
Raccolta
frazioni La separazione delle molecole dipende dalle interazioni delle molecole stesse con la fase
stazionaria, che consentono la ripartizione delle componenti tra le due fasi. Infatti, un
concetto fondamentale in tutte le tecniche di cromatografia è quello di coefficiente di
partizione.
Il coefficiente di partizione, Kd , descrive il modo in cui un composto si distribuisce tra due
fasi immiscibili; ad una determinata temperatura, per una sostanza che si distribuisce tra
volumi uguali di due fasi tra loro immiscibili, A e B, il valore di questo coefficiente è una
costante e si definisce:
Kd =
concentrazione nella fase A
concentrazione nella fase B
Nel caso i volumi delle due fasi non siano uguali, si preferisce considerare le quantità totali
di sostanza in ciascuna fase (concentrazione x volume) e si parla di coefficiente di
partizione effettivo. E’ chiaro che per ottenere una separazione il più possibile efficace tra
le componenti di una miscela sarà necessario scegliere le fasi stazionaria e mobile in
modo tale che le varie molecole della miscela abbiano coefficienti di partizione tra le due
fasi il più possibile diversi
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Cromatografia su colonna (continuazione)
Un tipico sistema cromatografico su colonna include: un serbatoio per la fase mobile,
collegato alla cima della colonna; la colonna stessa, contenente la fase stazionaria
(tipicamente, una resina idratata) e dotata di un sistema di rilascio (nel caso più semplice,
una valvola a farfalla); un raccoglitore di frazioni.
A
B
Contenitore
eluente
Pompa
Eluente
Eluente
Tappo
Colonna
Materiale
impaccato
Setti di nylon
Tappo
Lana di
vetro
Uscita eluato (al
rivelatore e/o al
collettore di
frazioni
Il flusso della fase mobile entro la colonna può avvenire semplicemente per effetto della
gravità (come nel caso ‘A’ illustrato sopra) oppure per azione di una pompa (caso ‘B’). In
molti sistemi semplici di cromatografia una pompa peristaltica si trova a valle della
colonna, anziché a monte.
Le pressioni richieste per il funzionamento dei diversi tipi di cromatografia dipendono dalla
resistenza opposta al flusso da parte della matrice. Nel caso di una matrice che opponga
una resistenza minima, la forza di gravità o una pompa peristaltica sono sufficienti per
mantenere un buon il flusso e si parla di LPLC (low pressure liquid chromatography; le
pressioni in gioco sono inferiori alle 5 atmosfere).
Per sistemi con resistenze maggiori, si ricorre a pompe più sofisticate e si parla di MPLC
(medium pressure – pressioni fino a 50 atmosfere) o HPLC (high pressure liquid
chromatography, che richiede colonne in metallo e che vedremo più in dettaglio più
avanti).
All’uscita della colonna e prima del raccoglitore di frazioni può trovarsi un rivelatore (ad
esempio, un sistema spettrofotometrico) che permetta di rilevare la presenza dei composti
d’interesse nell’eluato. L’andamento del segnale proveniente dal rivelatore in funzione del
tempo di eluizione costituisce un cromatogramma.
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CROMATOGRAFIA – NOMENCLATURA E CENNI DI TEORIA
Un esempio di cromatogramma è dato nella figura sotto. I picchi del cromatogramma
rivelano la presenza di materiale (ad es., proteine) nell’eluato. I principali parametri da
valutare nell’esame di un cromatogramma sono: tempo morto; tempo di ritenzione;
larghezza dei picchi.
Il tempo morto (tM) rappresenta il
tempo che impiega un componente
non trattenuto o la fase mobile per
arrivare al rivelatore.
Il tempo di ritenzione di un picco (tr)
è il tempo che intercorre dall'introduzione del campione al momento in
cui l'apice del picco raggiunge il
rivelatore.
S
e
g
n
a
l
e
Tempo
Nella figura sopra, (tr)A e (tr)B sono i tempi di ritenzione per i composti A e B mentre wA e
wB sono le larghezze alla base dei picchi A e B. I picchi cromatografici assumono di solito
la forma di una gaussiana, e la larghezza del picco viene calcolata come uguale a quattro
volte le deviazione standard (σ ).
Risoluzione - Il buon esito di ogni procedura cromatografica si valuta mediante la
capacità di separare completamente un composto da una miscela di altri composti simili.
Un primo parametro da considerare è la separazione dei picchi, cioè la differenza in tr tra
un picco ed il picco più vicino. Un parametro più importante è la risoluzione (Rs), che
considera non solo i tempi di ritenzione ma anche le ampiezze:
Rs = 2
( t r )B − ( t r ) A
w A + wB
Si può dimostrare che quando Rs = 1,5 la sovrapposizione dei picchi è <0.5%.
Cosa determina la larghezza delle bande cromatografiche? Ciascun composto entra
nella resina impaccata sotto forma di una banda discreta e piuttosto stretta (la larghezza
dipende dal volume del campione caricato). Questa banda tende ad allargarsi mentre il
composto si muove nella colonna a causa di tre fattori principali:
- Le molecole di soluto hanno diversi possibili
Colonna
percorsi all’interno della colonna
- Il soluto tende a diffondere longitudinalmenFlusso
te lungo la colonna.
- Per raggiungere l’equilibrio tra fase mobile e
fase stazionaria dettato dal coefficiente di
partizione, ogni composto ha a disposizione
solo un tempo finito a causa del flusso.
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Piatti teorici
L'efficienza di un sistema cromatografico e in particolare di una colonna, si quantifica con il
cosiddetto numero di piatti teorici N. In questo caso la cromatografia si rifà alle colonne di
distillazione frazionata nelle quali maggiore è il numero di piatti di distillazione più
efficace è la stessa. Un piatto teorico è la più piccola zona adiacente all'interno della
colonna in cui il soluto raggiunge un equilibrio tra fase mobile e stazionaria.
Il numero di piatti teorici si calcola considerando la larghezza del picco, in quanto più stretti
sono i picchi, più efficiente è la colonna. Il numero dei piatti teorici, N, è dato da
t 
N = 16 r 
w
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(In realtà, questa trattazione è piuttosto grossolana, perché le
dimensioni di un picco dipendono non solo dalla natura della
colonna, ma anche dal volume di campione caricato, dalla
larghezza della colonna, dalla velocità di flusso etc.). Il numero
di ‘piatti teorici’ di una colonna è collegato alla risoluzione
perché, sostanzialmente, un piatto teorico è la più piccola ‘fetta’
della colonna dove due molecole dotate di diverso coefficiente
di ripartizione hanno la possibilità di dimostrare diverse velocità
di migrazione: migliore una colonna, minore l’altezza del piatto
teorico (lo ‘spessore’ della fetta). Il numero dei piatti, e quindi la
risoluzione, può essere aumentato aumentando la lunghezza
della colonna, ma il limite a questo approccio consiste
nell’allargamento del picco per fenomeni di diffusione.
Una variante dell’equa­zione data sopra, ottenu­ta considerando il picco come una gaussiana e utile per ottenere N diret­tamente dal cromato­gramma, è la seguente:
I principi che descrivono l'efficienza cromatografica si possono riassumere nell'equazione
di van Deemter, che esprime l'altezza del piatto teorico (h) in funzione della velocità di
flusso della fase mobile (V). Minore è il valore di h, maggiore è il numero di piatti teorici
contenuti nella colonna e quindi maggiore sarà la sua efficienza. L'equazione di van
Deemter è la seguente:
h=A+
B
+C×V
V
A - è una costante che dipende dalle dimensioni e h
forma dei granuli della fase stazionaria (influenza
i diversi possibili percorsi del soluto);
B - coefficiente di diffusione longitudinale:
(esprime la tendenza delle molecole di soluto a
diffondere nella fase mobile, che è maggiore a
basso flusso)
C - resistenza al trasferimento di massa, (esprime
la difficoltà a raggiungere l’equilibrio tra fase
mobile e fase stazionaria dettato dal coefficiente
di partizione, e la sua importanza aumenta
all’aumentare della velocità di flusso).
B
V
Cx
A
Velocità di flusso
Rappresentazione grafica dell’equazione di van Deemter
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CROMATOGRAFIA DI ESCLUSIONE ( o GEL-FILTRAZIONE )
Per la separazione di molecole in base alla loro
forma e al loro peso molecolare vengono utilizzate le
proprietà di setaccio molecolare che sono proprie di
numerosi materiali porosi.
I materiali usati di solito a questo scopo sono
polimeri presenti sotto forma di un reticolo
tridimensionale poroso che conferisce loro proprietà
di gel.
Da qui il termine di gel-filtrazione per descrivere la
cromatografia che utilizza questi materiali.
Microstruttura della
matrice: particelle
La cromatografia ad esclusione si fonda su un principio abbastanza semplice: una colonna
di particelle di gel è in equilibrio con un solvente adatto alle molecole da separare. Le
molecole più grandi, completamente escluse dai pori, rimangono nel volume vuoto (o
volume escluso) e passano attraverso gli spazi interstiziali, mentre le molecole più piccole
si distribuiscono nel solvente presente sia all'interno sia all'esterno del setaccio molecolare
e attraversano quindi la colonna a velocità più bassa.
Per ciascun tipo di gel il
coefficiente di ripartizione Kd
(tra il solvente interno e quello
esterno al gel) di un
determinato soluto è funzione
del peso molecolare del
soluto esso. Se la molecola del
soluto è così grande da essere
esclusa dal solvente interno al
gel, Kd è uguale a 0 e la particella, non trattenuta, viene
eluita nel tempo morto. Se
invece il soluto è abbastanza
piccolo da essere liberamente
permeabile alle particelle di gel,
Kd = 1 (cioè la particella
partiziona egualmente tra
interno ed esterno).Poiché in
ogni gel esiste una certa
variabilità della porosità delle
particelle, per i soluti di
grandezza intermedia esisterà
una parte di solvente interno
alle particelle di gel che sarà
accessibile e una parte che non
lo sarà e quindi Kd sarà
compreso tra 0 e 1.
Proteina
piccola
Volume
vuoto
Proteina
media
Volume
della fase
stazionaria
Proteina
grande
Volume interno
E' proprio la variabilità di Kd tra questi due estremi che rende possibile, nei vari gel, la
separazione di soluti in un ristretto campo di pesi molecolari.
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Cromatografia di gel-filtrazione (continuazione)
Le matrici usate comprendono destrani a legami crociati, legami ottenuti da reazione con
epicloridrina (Sephadex), agarosio (Sepharose, Bio-Gel A, Savagac), poliacrilammide
(Bio-Gel P), poliesteri, gel di silice, poliacrilomorfolina e polistireni.
Queste matrici funzionano sotto forma di gel idratato, ma spesso sono vendute sotto forma
di polvere secca, che deve essere idratata prima di impaccare la colonna. L’idratazione si
ottiene in genere mescolando una parte di polvere con dieci di soluzione tamponata, e
lasciando che la matrice assorba tampone per parecchie ore, mescolando di tanto in tanto.
L’impaccamento della colonna si ottiene, in estrema sintesi, sospendendo la matrice in
tampone ed aggiungendola delicatamente all’interno della colonna. Il rubinetto d’uscita
deve essere aperto, così che ci sia flusso di liquido nella colonna mentre la resina decanta
e si assesta (dopo avere versato tutta la matrice, si continua ad aggiungere tampone).E’
importante effettuare l’impaccamento in un’unica fase ed evitare di intrappolare bolle d’aria
nel gel, per evitare variazioni nella uniformità della matrice.
Risoluzione: nella gel filtrazione, la risoluzione dipende dalle dimensioni delle particelle
di gel, dalle dimensioni dei pori, dalla lunghezza e dal diametro della colonna e dal
volume del campione, che in questo sistema è particolarmente critico. Generalmente si
consiglia di usare volumi di campione <5% del volume totale della resina impaccata.
IMPIEGHI SPERIMENTALI
Purificazione: la principale applicazione della cromatografia a esclusione è la
purificazione delle macromolecole biologiche. Ovviamente, le molecole di interesse
devono cadere entro l’intervallo di separazione dello specifico gel usato, quindi per
scegliere una certa matrice per la purificazione dobbiamo avere un’idea preliminare delle
dimensioni o del peso molecolare della particella.
Set di proteine a pesi molecolari
Con questa tecnica si possono purificare proteine
noti caricate sulla resina per gel(di solito si usa come ultimo passaggio in un
filtrazione (HPLC) Bio-Sil SEC 250
protocollo di purificazione), acidi nucleici
(ad es., plasmidi), polisaccaridi ed anche virus.
Si possono separare anche composti a basso
peso molecolare: aminoacidi da peptidi, peptidi
ottenuti dall'idrolisi parziale delle proteine,
oligonucleotidi ottenuti per idrolisi parziale degli
acidi nucleici e destrani a basso peso molecolare.
Determinazione del peso molecolare di
proteine: il tempo di ritenzione per le proteine
globulari dipende come detto dalle dimensioni e
quindi dalla massa molecolare. Per una data
colonna, i tempi di ritenzione di diverse proteine
globulari dipendono linearmente dalla massa delle
proteine stesse (almeno per certi intervalli di valori
di massa). Una volta calibrata la colonna con
proteine globulari di massa nota, è possibile
dedurre con buona approssimazione la massa
ignota di una proteina globulare dal suo tempo di
ritenzione.
1- Volume escluso
2 - Tiroglobulina (670000 Da)
3 - γ -globulina (158000 Da)
4 - Ovalbumina (44000 Da)
5 - Mioglobina (17000 Da)
6 - Cobalamina (1350 Da)
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Dissalazione: si possono separare soluti ad alto
peso molecolare dai sali o dai solventi organici
usando colonne impaccate con una resina per gelfiltrazione a pori piccoli (ad es., una Sephadex
G-25; comunque, il limite di esclusione del gel
deve essere inferiore alle dimensioni della
macromolecola d’interesse). Infatti, mentre le
macromolecole vengono eluite con il volume
vuoto, i sali, a basso peso molecolare, vengono
trattenuti dalla matrice. Il sistema funziona bene
anche quando si usano delle microcolonne, in cui
il flusso dell’eluente è garantito dalla
centrifugazione della colonna entro un tubo da
centrifuga (eppendorf). Questo metodo di
dissalazione è più rapido ed efficiente di quello per
dialisi: si applica, per esempio, per allontanare il
fenolo da preparazioni di acidi nucleici, il solfato
d'ammonio da preparazioni di proteine, i
monosaccaridi dai polisaccaridi e gli aminoacidi
dalle proteine.
Studi di legame: la cromatografia di esclusione
può essere usata per studiare il legame reversibile di un ligando ad una macromolecola proteica. In questo caso la colonna viene equilibrata
con una soluzione a concentrazione nota di
ligan-do (A). Una quantità nota di proteina viene
sciolta nella stessa soluzione di ligando caricata
su co-lonna. La rilevazione continua dell'effluente
per-metterà di registrare una linea di base
costante dovuta all'assorbimento del ligando.
Quando verrà eluito il complesso macromolecolaligando (PA) si avrà un picco positivo dovuto a (A
+ PA) seguito da un picco negativo dovuto alla
sottrazione di ligando libero operato dalla
macromolecola al suo passaggio (A - PA).
Campione
Colonna
Centrifugazione
Sali, molecole a basso
peso molecolare
Proteina dissalata
S
e
g
n
a
l
e
[A]+[PA]
[A]
[A]-[PA]
0
20
40
60
Tempo (minuti)
SITI WEB INTERESSANTI
Sito Web
Commento
www.bath.ac.uk/~cesjh/adsorb1.htm
Un corso sulla separazione cromatografica delle
proteine, con una trattazione dettagliatissima della
teoria dell’adsorbimento, della ripartizione etc. Per
quelli di voi che amano la matematica.
Dall’Università di Bath (UK).
ntri.tamuk.edu/hplc/size.html
Un trattamento didattico abbastanza accurato
della cromatografia di esclusione. Dalla Texas
A&M University di Kingsville (USA)
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CROMATOGRAFIA A SCAMBIO IONICO
In questo tipo di cromatografia, l’adsorbimento delle particelle sulla fase stazionaria è
determinato da interazioni di tipo elettrostatico (gruppi con cariche di segno opposto). Le
proteine, possiedono gruppi ionizzabili e il fatto che essi possano portare una carica netta
positiva o negativa può essere utilizzato nella separazione di miscele che li contengano.
La carica netta che questi composti presentano dipende dal loro pK e dal pH della
soluzione secondo l'equazione di Henderson-Hasselbalch.
Le separazioni a scambio ionico sono condotte in colonne impaccate con una resina
scambiatrice di ioni. Si tratta cioè di una resina in cui una matrice solida di supporto, in
forma di sferule porose porta covalentemente legati dei gruppi funzionali carichi.
Negli scambiatori anionici
(come la DEAE nello
schema a lato) la resina
DEAE
CM
espone gruppi carichi
positivamente (in generale,
gruppi basici) che
attraggono molecole
cariche negativamente, e
ne favoriscono
l’adsorbimento sulla fase
solida, mentre le molecole
neutre o cariche poScambiatore anionico
Scambiatore cationico
sitivamente vengono eluite
nel tempo morto della
colonna. Gli scambiatori
cationici possiedono
invece gruppi carichi
negativamente (acidi) e
attraggono, quindi,
molecole cariche
positivamente.
Si parla anche di
scambiatori ‘forti’ o
‘deboli’, in riferimento al
pK dei gruppi carichi
attaccati alla resina: uno
scambiatore forte ha un pK molto alto (per le basi) o molto basso (per gli acidi), tale per cui
rimane ionizzato in un largo intervallo di pH.
Il tipo di scambiatore da usare dipende ovviamente dal punto isoelettrico (pI) di una
proteina, nonché dalla sua stabilità in funzione del pH.
Se una proteina è stabile al di sopra del suo pI, conviene lavorare sopra il pI ed usare uno
scambiatore anionico; viceversa, se la proteina è stabile al di sotto del suo pI, conviene
lavorare a basso pH ed usare uno scambio cationico. Un suggerimento empirico dato da
molti autori è di lavorare ad un pH distante circa 1 unità dal pI – questo consente di avere
una carica netta sufficiente per favorire l’adsorbimento, senza richiedere però condizioni
troppo drastiche per l’eluizione.
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Più alta la forza ionica,
maggiore la competizione
degli ioni in soluzione con la
proteina. Per questo,
solitamente le proteine
vengono eluite in gradiente
di pH oppure di forza
ionica: a seconda della loro
carica netta complessiva più
o meno elevata, proteine
diverse scenderanno in punti
diversi del gradiente.
Un gradiente di forza ionica
è preferibile nella maggior
parte dei casi perché più
compatibile con la stabilità
proteica. Inoltre, l’eluizione
con gradiente di pH può
essere meno efficiente a
causa dell'effetto Donnan;
questo effetto è indice della
repulsione elettrostatica tra
ioni di segno uguale che si
instaura all'interno della
colonna e che determina una
diminuzione di pH diversa
nel volume interno della
matrice dove avviene lo
scambio rispetto al volume
vuoto della colonna.
[NaCl] bassa
[NaCl] elevata
[NaCl] intermedia
Proteina (pH>pI)
% di
proteina
eluita
Ioni nel
tampone
(Cl-)
Forza ionica
% di
protein
a
eluita
Per l’eluizione è possibile utilizzare
gradienti continui o discontinui.
Nei gradienti discontinui si utilizzano
soluzioni eluenti a concentrazione
crescente mentre nei gradienti continui si
ha una continua e lineare variazione di
concentrazione.
Proteina
A
Proteina
B
Proteina
C
Proteina
D
Forza ionica
Gradiente
discontinuo
0.8
[NaCl] (M)
Eluizione Nella cromatografia a scambio ionico,
l’interazione tra proteina e
fase stazionaria dipende (a)
dalla carica della proteina
che, come detto, dipende a
sua volta dal pH; (b) dalla
forza ionica della fase
mobile.
Gradiente
continuo
0.4
0.0
0
20
40
Tempo (minuti)
60
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Cromatografia a scambio ionico (continuazione)
Molti scambiatori ionici sono costituiti da matrici di cellulosa modificata chimicamente: ad
es. la carbossimetilcellulosa (CM-cellulosa) e la DEAE-cellulosa. Analoghi ai derivati della
cellulosa sono i derivati del destrano e dell'agarosio (Sephadex e Sepharose). Questi
scambiatori sono affini ai materiali impiegati nella gel filtrazione e presentano quindi limiti
d'esclusione. Pertanto uniscono al processo di scambio ionico quello di filtrazione
molecolare, migliorando così la risoluzione complessiva soprattutto nella separazione di
proteine ad elevato peso molecolare e di acidi nucleici. Vice versa, per la separazione di
molecole piccole sono preferibili supporti poco porosi o con bassi limiti di esclusione.
Resina
Supporto
Gruppo funzionale
Tipo
DEAE Sepharose (Pharmacia)
DEAE Bio-Gel A (Bio-Rad)
Agarosio
-CH2CH2N+H(CH2CH3) 2 Scambio anionico
dietilaminoetil (DEAE) (debole)
QAE Sephadex C50
(Pharmacia)
Destrano
Dietil-(2-idrossipropil)
aminoetil (un ammina
quaternaria)
Scambio anionico
(forte)
CM Sepharose (Pharmacia)
Agarosio
-CH2COOCarbossimetil
Scambio cationico
(debole)
SP Sephadex C50 (Pharmacia)
Destrano
-(CH2) 3SO3Sulfopropil
Scambio cationico
(forte)
Altre resine usate nella separazione di materiali biologici sono costituiti da polimeri
sintetici (di stirene e di divinilbenzene). Inoltre, sono state recentemente introdotte per la
costituzione delle cosiddette resine ‘tentacolari’. Sono resine in cui i gruppi carichi sono
legati a bracci spaziatori a loro volta fissati su un supporto rigido. Quando una proteina si
lega ad una normale fase stazionaria subisce una alterazione della sua struttura
tridimensionale che può in casi estremi portare addirittura alla denaturazione della
proteina. Gli scambiatori tentacolari si protendono nello spazio all'interno della colonna e
permettono l'attacco della proteina senza che questa si deformi.
Nella scelta di una resina per lo scambio ionico è opportuno considerare anche la forma
ionica (cioè, qual è il controione normalmente presente nella fase stazionaria) e la
dimensione delle particelle. Molte resine per scambio ionico sono disponibili in diverse
forme ioniche, ed è possibile convertire una forma ionica nell’altra (‘scambiare’ il
controione). Diversi controioni avranno diverse affinità per una resina, e sarà quindi più o
meno facile per le molecole del campione spiazzare questi controioni per legarsi.
Per quanto riguarda le dimensioni delle particelle idratate (nell’ordine delle decine di µm),
possono variare da resina a resina e anche da forma ionica a forma ionica. Sono
importanti per la risoluzione: in generale, particelle piccole consentono una risoluzione
maggiore ma richiedono flussi più bassi.
L'efficienza della cromatografia a scambio ionico non è strettamente legata al volume di
campione applicato alla colonna come nella cromatografia ad esclusione e quindi
possiamo caricare sulla colonna volumi anche elevati di materiale.