Fluorescenza: Principi e metodi

Giorgio Sartor
Laboratorio di fisiologia e biochimica ambientale (EPB)
Indice
Scienze Ambientali – Università di Bologna a Ravenna
• La teoria.
• La pratica
– Molecole fluorescenti.
– La strumentazione.
– Gli spettri.
– La fluorescenza in laboratorio.
– Le applicazioni in biologia.
Spettroscopia di Fluorescenza
Principi e metodi
gs/epb 2004
Interazione tra energia e materia
Spettroscopia
• Tutte le spettroscopie consistono nella misura
delle interazione energia-materia.
• L’assorbimento di energia da parte di una
molecola può provocare delle variazioni
chimiche o fisiche (proprietà degli elettroni o
del nucleo) della specie chimica.
• L’assorbimento o l’emissione possono fornire
informazioni sulla struttura della molecola e/o
le variazioni che una essa subisce.
gs/epb 2004
Spettroscopia di fluorescenza
2
Spettroscopia di fluorescenza
3
λ (nm)
ν (Hz)
Regione dello
spettro
Interazioni
(Spettroscopia)
106 - 1010
3·1011 - 3·107
Radio
Spin nucleare, spin
elettronico
(NMR – EPR)
103 - 105
3·1014 - 3·1012
Radiazioni
InfraRosse
Vibrazioni, rotazioni
(IR)
4·102 - 8·102
(400-800)
7.5·1014 - 3·1014
Luce Visibile
2·102 - 3·102
(200-300)
1.5·1015 - 1·1015
Luce
UltraVioletta
10-3 - 100
3·1020 - 3·1017
Raggi X
gs/epb 2004
Transizioni elettroniche
(Spettroscopie ottiche)
Gusci interni
(Spettroscopie X)
Spettroscopia di fluorescenza
4
Assorbimento e fluorescenza
• La luminescenza è un processo di emissione di radiazioni
a seguito di un assorbimento di energia.
• Si parla di fluorescenza quando si osserva un processo di
emissione di luce a seguito del rilassamento di uno stato
elettronico eccitato generato da un assorbimento di luce.
• La scala dei tempi con la quale avviene l’emissione è
diversa da quella con la quale avviene l’assorbimento.
• Come conseguenza sono diverse le proprietà della materia
che influiscono sui due fenomeni e, quindi, diverse le
informazioni che se ne possono ricavare.
gs/epb 2004
Spettroscopia di fluorescenza
5
gs/epb 2004
Spettroscopia di fluorescenza
6
1
Tempi
Principio di Frank-Condon:
• ASSORBIMENTO: 10-15 s (fs)
• EMISSIONE:
10-12 s - 103 (ps - ore)
Durante la transizione NON
CAMBIA LA POSIZIONE degli
atomi della molecola.
gs/epb 2004
– Fluorescenza:
– Fosforescenza:
7
Spettroscopia di fluorescenza
gs/epb 2004
(Diagramma di Jablonsky)
Stato di singoletto eccitato
• Svantaggi
Stato di tripletto
– Non tutte le molecole
che assorbono
emettono
– Segnali significativi
anche a concentrazioni
bassissime (nM)
– Effetto del solvente
– Unità arbitrarie
S1
T1
Energia
– Non tutte le molecole
che assorbono
emettono
– Segnali significativi
anche a concentrazioni
bassissime (nM)
– Effetti del solvente
– Unità arbitrarie
8
Spettroscopia di fluorescenza
Le transizioni elettroniche
Spettroscopia di fluorescenza vs. Assorbimento
• Vantaggi:
10-12 s - 10-6 s (ps - µs)
10-6 - 103 (µs - ore)
Assorbimento
Fluorescenza
Fosforescenza
S0
Stato fondamentale
Intersystem crossing
Conversione interna
gs/epb 2004
Spettroscopia di fluorescenza
9
gs/epb 2004
Tipi di transizione
Spettroscopia di fluorescenza
10
Transizioni elettroniche
• L’assorbimento di luce da parte di una molecola
corrisponde ad un assorbimento di energia che
promuove un elettrone da uno stato fondamentale
ad uno stato eccitato (singoletto eccitato).
• Una volta eccitata elettronicamente una molecola
torna al più basso stato eccitato attraverso una
serie di rilassamenti vibrazionali e rotazionali che
dissipano energia senza emissione di luce
(conversione interna).
gs/epb 2004
Spettroscopia di fluorescenza
11
• Le transizioni elettroniche coinvolte sono in
genere del tipo n → π* o π → π* (molto
raramente sono coinvolti elettroni σ).
• Gli elettroni coinvolti nella transizione di
fluorescenza sono generalmente elettroni π.
• La fluorescenza si osserva generalmente nei
composti che che presentano transizioni π* → π.
gs/epb 2004
Spettroscopia di fluorescenza
12
2
Significato di kR
Lo stato eccitato
• Assorbimento
– Formazione dello
stato eccitato
• Emissione
– Decadimento dello
stato eccitato
M + hν
M∗
kR
M*
• kR è la costante di velocità
della reazione di decadimento
dello stato eccitato e viene
espressa in s-1 (reazione di I
ordine) .
RAPPRESENTA IL
NUMERO DI EVENTI
PER L’UNITÀ DI TEMPO
M + hν'
v = - kR [M*]
13
Spettroscopia di fluorescenza
Cinetica dei fenomeni
•
•
•
•
gs/epb 2004
gs/epb 2004
kR
M + hν'
M*
kIC
Φf =
QUENCHING
kq[Q]
M*Q
M+Q
M
Numero di fotoni emessi
Numero di fotoni assorbiti
• Per Φf = 0 la molecola non è fluorescente (in quelle condizioni).
Φf = quantum yield
Spettroscopia di fluorescenza
16
0 ≤ Φf ≤ 1
Q
• Il rapporto tra fotoni emessi ed assorbiti è il rendimento
quantico della molecola.
gs/epb 2004
Spettroscopia di fluorescenza
• Il quantum yield (rendimento quantico, efficienza quantica) della
molecola.
kCI
M + hν
14
Φf = quantum yield
In sintesi
M + kcal
Spettroscopia di fluorescenza
IL NUMERO DI FOTONI EMESSI È
MINORE DEL NUMERO DI FOTONI
ASSORBITI
15
Spettroscopia di fluorescenza
d[M*]/dt = - kR [M*]
• Oltre a conversione interna ed intesystem
crossing, altri processi, non radiativi, competono
con la fluorescenza (processo radiativo).
• In soluzione questi processi depopolano lo stato
eccitato in modo non radiativo, quindi:
I processi di fosforescenza ed intersystem crossing
prevedono l’inversione dello spin dell’elettrone, processo
proibito, che però avviene poiché esiste l’interazione spinorbita, cioè l’accoppiamento dello spin degli elettroni con i
momenti angolari orbitali.
gs/epb 2004
M + hν'
Processi radiativi e non-radiativi
kR = 108 s-1
kP = 102-104 s-1
kIC = 108 s-1
kCI = 1013 s-1
Fluorescenza
Fosforescenza
Intersystem crossing
Conversione interna
kR
kR = 1/τR (s-1)
d[M*]/dt = - kR [M*]
gs/epb 2004
M*
17
gs/epb 2004
Spettroscopia di fluorescenza
18
3
Illuminazione
Condizioni fotostazionarie
• Corrispondono ad una eccitazione costante con intensità
pari a I0
Le condizioni di illuminazione con le quali
si può rivelare la fluorescenza sono:
kA
M + hν
kR
M + hν' Fluorescenza
M*
ki
• Condizioni fotostazionarie
• Condizioni transienti
M
Altri processi
di inattivazione
ki = kIC + kCI + kq[Q] + ...
d[M*]/dt = kA [M] hν − (kR + ki) [M*]
• In condizioni fotostazionarie (equilibrio)
d[M*]/dt = 0; kA[M]hν = (kR + ki) [M*]
gs/epb 2004
19
Spettroscopia di fluorescenza
gs/epb 2004
Condizioni fotostazionarie
kAkR[M]hν = kR(kR + ki) [M*]
k R + ki
Φf =
gs/epb 2004
=
kR[M*]
kA[M]hν
fotoni emessi
per unità di tempo
• Illuminazione con un
di luce di durata
trascurabile.
“∆ function”
kR
t
kR + ki
21
gs/epb 2004
Condizioni transienti
• da cui:
22
d[M*]/dt = − (kR + ki) [M*]
• Integrando fra 0 e t:
M + hν' Fluorescenza
ln[M*]t = − (kR + ki) t + costante
M*
M
Spettroscopia di fluorescenza
Condizioni transienti
• Un impulso provoca una concentrazione iniziale
(t = 0) di M* ([M]0) che può decadere, come già
visto, con emissione o no di luce.
ki
FLASH
I
fotoni assorbiti
per unità di tempo
Spettroscopia di fluorescenza
kR
20
Condizioni transienti
In condizioni fotostazionarie (equilibrio)
kR
Spettroscopia di fluorescenza
Altri processi
di inattivazione
t=0
[M*] = [M*]0
costante = ln[M*]
• da cui…
gs/epb 2004
Spettroscopia di fluorescenza
23
gs/epb 2004
Spettroscopia di fluorescenza
24
4
Condizioni transienti
Condizioni transienti
• Moltiplicando entrambi i termini per kR si ottiene:
kf = kR + ki
kf = 1/τf
• Se definiamo:
• Abbiamo la funzione di
decadimento di fluorescenza:
[M*]t = [M*]0 e
gs/epb 2004
•
t
τf
-
}
}
• e:
kR[M*]t = kR[M*]0 e
-
Funzione di
decadimento
di fluorescenza
1
τf
gs/epb 2004
-
t
τf
Tempo di
vita media
di fluorescenza
1
kR + ki
τf =
25
Spettroscopia di fluorescenza
It = I0 e
26
Spettroscopia di fluorescenza
Decadimento di fluorescenza
Decadimento di fluorescenza
La funzione di decadimento può essere monoesponeziale (una sola
specie eccitata che decade con un unico tempo di vita):
• La funzione di decadimento può essere multiesponeziale
(due o più specie che decadono con diversi tempi di vita):
It = I0 e
-
t
τf
1.0
(
0.6
t
τ1
-
+ α2e
100 ns
50ns
0.4
20 ns
0.2
t
τ2
1.0
)
0.8
Frazione di molecole
0.8
Frazione di molecole
-
It = I0 α1e
τ 1 = 10 ns; τ 2 = 100 ns
0.6
1:3
1:1
0.4
3:1
0.2
10 ns
0.0
0.0
0
20
40
60
80
Tempo (ns)
Spettroscopia di fluorescenza
gs/epb 2004
100
0
27
gs/epb 2004
Condizioni transienti
kR
kR + ki
=
1
kR
τf
Φf =
τR
k
{kR + kIC + kCI + kq[Q] +
Φf =
Spettroscopia di fluorescenza
60
80
Tempo (ns)
100
28
29
gs/epb 2004
(s-1)
τ
τf =
gs/epb 2004
40
Relazioni fondamentali
• Per quanto riguarda il quantum yield:
Φf =
20
Spettroscopia di fluorescenza
=
k
kR + ki
1
kR + ki
k
kR + ki
τf
= τ
Spettroscopia di fluorescenza
30
5
Sono fluorescenti…
Identikit di una molecola fluorescente
• Una molecola è fluorescente quando:
• Gli aromatici ed alcuni loro derivati:
– Ha uno spettro di assorbimento (un elettrone, n
o π, raggiunge uno stato eccitato);
– Lo stato eccitato ha un tempo di vita (si rilassa
lo stato eccitato);
– Molecola planare
Benzene
Naftalene
Fenantrene
• COMPOSTI AROMATICI!!!
Perilene
Antracene
gs/epb 2004
31
Spettroscopia di fluorescenza
gs/epb 2004
Effetto dei sostituenti sulla fluorescenza del benzene
λex - λ em
(nm)
Molecola
Intensità
λex - λ em
(nm)
Molecola
Biomolecole fluorescenti…
O
285-265
N
H
18
270-320
O
17
310-400
10
NH2
275-345
O
7
310-405
I
0
N
20
-
Tyrosina (Y)
Fenilalanina (P)
CH3
N
N
CH3
OH
OH
OH
O
O
O P O P O
OH OH
NH3+
-
NH3+
NH3+
HO
O
HN
Cl
O
O
NH3+
Triptofano (W)
CH3
O
O
O
10
32
Spettroscopia di fluorescenza
Intensità
OH
270-310
Pirene
0
N
N
N
N
N
O
HO
NH2
H H NH2
O
NH2
O
O P O
OH
O
OH
HO
OH
33
Spettroscopia di fluorescenza
gs/epb 2004
…altre biomolecole fluorescenti…
CH2
H3C
CH3
N
N
H3C
CH3
HO
H3C
CH3
N
NH
Mg
N
CH3
O
O
HN
CH3
CH3
HO
O
HO
O
Ematoporfirina
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
GFP
CH3
gs/epb 2004
CH3
CH3
CH3
N
N
O
HO
OH
34
Spettroscopia di fluorescenza
Fluoroforo della GFP
• Il fluoroforo della
GFP proviene da
una modificazione
postrascrizionale
della proteina con
condensazione di
tre AA (Ser65,
Tyr66, Gly67)
OH
O
CH3
O
O
Clorofilla
N
H3C
H
CH3
N
O
P O
OH
NADH
FAD
gs/epb 2004
N
N
Tyr66
Ser65
Gly67
O
HO
O
HN
N
N
H
N
O
OH
H
N
O
NH2
O
N
H
O
OH
H3C
CH3
CH3
CH3
β-carotene
Spettroscopia di fluorescenza
35
gs/epb 2004
Spettroscopia di fluorescenza
36
6
Strumentazione
…e molecole fluorescenti usate in biologia
HO
H3C
N
CH3
O
CH3
N
N
CH3
+
N
N
N
O
CH3
Fluoresceina
H3C
Br-
H3C
COOH
Arancio di acridina
H2N
O
H3C
COOH
CH3
Rodamina B
H
SO3- N
CH3
gs/epb 2004
• Fluorimetro “statico”:
+
OH
Naftolo
CH3
NH2
Bromuro di etidio
N
NH2
H2N
NH
SO2Cl
Dansile
ANS
Spettroscopia di fluorescenza
N
H
NH
DAPI
37
– Sorgente: continua (lampada a scarica in Xenon).
– Misura: Φ f e gli spettri di emissione.
• Fluorimetro “dinamico”:
– Sorgente: pulsata (Laser, luce di sincrotrone,
lampada pulsata).
– Misura: tempi di vita di fluorescenza (τf).
gs/epb 2004
Schemi ottici
38
Spettroscopia di fluorescenza
Geometria a 90°
• A L: il più comune.
• A T: misure di anisotropia di fluorescenza.
• A 0°: microscopia, epiluminescenza, analisi
di superfici o strati.
Monocromatore
di eccitazione
Campione
Sorgente
Fenditure
Monocromatore
di emissione
Rivelatore
(fotomoltiplicatore)
gs/epb 2004
Spettroscopia di fluorescenza
39
gs/epb 2004
Fluorimetri
40
Spettroscopia di fluorescenza
Geometria a T
Monocromatore
di emissione
Fenditura
Monocromatore
di eccitazione
Campione
Sorgente
Fenditure
Rivelatore
(fotomoltiplicatore)
gs/epb 2004
Spettroscopia di fluorescenza
41
gs/epb 2004
Spettroscopia di fluorescenza
42
7
La “vetreria”
Geometria a 0°
• Vista la geometria degli strumenti i
campioni deve essere contenuti in
“cuvettes” che abbiano le quattro
pareti trasparenti.
• Possibilmente in quarzo (il vetro è
opaco nell’UV),
• Ma con sorgenti di alta intensità
(laser) il quarzo è (leggermente)
fluorescente.
gs/epb 2004
Specchio
Fenditure
Sorgente
Specchio
semiriflettente
Campione
(vetrino)
43
Spettroscopia di fluorescenza
Lampada
Filtro di eccitazione
Prisma semiriflettente
Obbiettivo
Oggetto
Filtro in emissione
Rivelatore
(fotomoltiplicatore)
Monocromatore
di eccitazione
Microscopio a fluorescenza
A.
B.
C.
D.
E.
F.
Monocromatore
di emissione
(filtro)
gs/epb 2004
Spettroscopia di fluorescenza
44
Microscopio a fluorescenza
F
C
A
B
D
E
gs/epb 2004
Spettroscopia di fluorescenza
45
Cosa si può vedere in un microscopia a
fluorescenza
gs/epb 2004
Spettroscopia di fluorescenza
46
Spettri di assorbimento ed eccitazione
• La differenza tra le due risposte spettrali
– Assorbimento è il segnale di estinzione della luce a
causa della transizione elettronica.
– Eccitazione è il segnale di emissione della luce
assorbita ad una data lunghezza d’onda.
Blu DAPI legato al DNA.
Rosso anticorpo
fluorescente legato al
centromero.
Verde anticorpo
fluorescente legato
alla tubulina.
gs/epb 2004
Spettroscopia di fluorescenza
• Quando una molecola emette luce significa che ha
sempre assorbito energia. Quando una molecola
assorbe non sempre emette luce.
47
gs/epb 2004
Spettroscopia di fluorescenza
48
8
Spettri di assorbimento ed emissione
• I fenomeni di disattivazione non radiativa (ki)
dissipano l’energia accumulata dallo stato eccitato.
• L’emissione avverrà quindi ad energia più bassa
(maggiore lunghezza d’onda).
• La differenza in energia è detta “Stokes’ shift”.
• Se la configurazione dello
stato eccitato è simile allo
stato fondamentale si
osserva una simmetria
speculare tra lo spettro di
eccitazione e lo spettro di
emissione.
E = hν; ν = c/λ
gs/epb 2004
Transizione simmetrica
49
Spettroscopia di fluorescenza
gs/epb 2004
Emissione
(Fluorescenza)
Assorbimento
60
40
20
0
350
400
450
500
550
600
m
E
Lunghezza d'
onda
gs/epb 2004
51
Spettroscopia di fluorescenza
gs/epb 2004
Intesità di fluorescenza (U.A.)
R
R 0m
Spettroscopia di fluorescenza
52
Artefatti spettrali
• Alcuni segnali che non derivano dalla
fluorescenza sono sempre presenti negli
spettri di eccitazione ed emissione:
100
Il DPH può subire
una isomerizzazione
cis-trans allo stato
eccitato. Lo spettro di
emissione non è
speculare a quello di
eccitazione.
n
R 0n
Difenilesatriene (DPH)
•
50
Spettroscopia di fluorescenza
• Se lo stato eccitato subisce
una perturbazione (cambia
la struttura della molecola,
avvengono reazioni allo
stato eccitato, vi è energy
transfer o charge transfer,
ecc.) si perde la simmetria
speculare tra lo spettro di
eccitazione e lo spettro di
emissione.
80
300
R
Transizione asimmetrica
100
Intensità di fluorescenza (U.A.)
Il perilene ha una
struttura compatta, non
ci sono variazioni di
struttura allo stato
eccitato,
si
ha
simmetria speculare.
n
R 0n = R 0m
Perilene
•
m
E
Assorbimento
Emissione
(Fluorescenza)
80
60
– Rayleigh scattering
– Raman
40
20
0
250
300
350
400
450
500
550
Lunghezza d'
onda
gs/epb 2004
Spettroscopia di fluorescenza
53
gs/epb 2004
Spettroscopia di fluorescenza
54
9
Rayleigh scattering
Osservatore
gs/epb 2004
55
Spettroscopia di fluorescenza
gs/epb 2004
S1
Energia
Sole
• Emissione di fotoni
alla stessa energia dei
fotoni assorbiti dovuta
alla diffusione
elastica.
• È funzione inversa di
λ4 e diretta di r6.
• La luce di scattering è
polarizzata.
Fluorescenza
Rayleigh
scattering
Rayleigh
scattering
La forte dipendenza del
Rayleigh scattering dalla
lunghezza d’onda aumenta
l’intensità della luce a
lunghezza d’onda più corta
dando al cielo il colore blu.
Lo scattering a 400 nm è
circa 10 volte maggiore
rispetto a quello a 700 nm.
A secondo dell’angolo di
incidenza il cielo si colora
di rosso, gli oggetti lontani
si scuriscono ecc.
• Ciò che rende il cielo colorato.
Assorbimento
Rayleigh scattering
S0
Spettroscopia di fluorescenza
56
Raman
Rayleigh scattering
• Picchi satelliti del picco di Rayleigh dovuti alle
transizioni vibrazionali del solvente ([H2O] = 55M).
• I picchi sono posizionati ad una distanza fissa (in
termini di energia) prima e dopo il picco di Rayleigh
(Stokes e anti-Stokes).
• La spettroscopia Raman è una tecnica che investiga
gli stati vibrazionali (e rotazionali) delle molecole.
Ha bisogno di sorgenti molto intense (laser o luce di
sincrotrone) per dare informazioni.
gs/epb 2004
57
Spettroscopia di fluorescenza
gs/epb 2004
Rayleigh scattering e Raman
Spettroscopia di fluorescenza
58
Indice
Intensità di fluorescenza (U.A.)
30
• La teoria.
• La pratica
25
Rayleigh
scattering
20
15
10
Raman
5
0
300
350
400
450
500
Lunghezza d'
onda
•
•
Spettro di emissione di H2O con λex= 337 nm
Nello spettro di eccitazione la situazione è rovesciata: prima il Raman poi il
Rayleigh. La differenza in termini di λ tra i due picchi nelle due situazioni è
diversa ma corrisponde ad una uguale differenza in termini di energia.
gs/epb 2004
Spettroscopia di fluorescenza
59
– Molecole fluorescenti.
– La strumentazione.
– Gli spettri.
– La fluorescenza in laboratorio.
– Le applicazioni in biologia.
gs/epb 2004
Spettroscopia di fluorescenza
60
10
La fluorescenza in laboratorio
Spettri in soluzione
• Spettro di emissione
• Ambiente isotropo (soluzione):
–
–
–
–
–
Informazioni dagli spettri;
Artefatti ed errori strumentali ed a carico del campione;
Determinazione di Φf;
Quenching;
Reazioni allo stato eccitato.
– Si illumina il campione con luce a lunghezza
d’onda costante e si fa una scansione del
monocromatore di emissione.
• Spettro di eccitazione
– Si fa una scansione del monocromatore di
eccitazione tenendo fissa la lunghezza d’onda
del monocromatore di emissione.
• Ambiente anisotropo (macromolecole e/o strutture
sopramolecolari):
– Polarizzazione ed anisotropia di fluorescenza.
gs/epb 2004
61
Spettroscopia di fluorescenza
gs/epb 2004
Spettri eccitazione e di emissione
• Spettro di emissione:
• Spettro di eccitazione:
– λem = 430 nm,
scansione
dell’eccitazione da
250 nm a 420 nm
gs/epb 2004
62
Informazioni dagli spettri
• Intensità e posizione delle bande
100
Intesità di fluorescenza (U.A.)
– λex = 340 nm,
scansione
dell’emissione da 370
nm a 550 nm
Spettroscopia di fluorescenza
Assorbimento
(Eccitazione)
80
– Intorno chimico;
– Reazioni allo stato eccitato;
– Reazioni allo stato fondamentale;
– Interazione con altre molecole;
– Concentrazione;
Emissione
(Fluorescenza)
60
40
20
0
250
300
350
400
450
500
550
Lunghezza d'
onda
Spettroscopia di fluorescenza
63
gs/epb 2004
Spettroscopia di fluorescenza
64
Correzione per le fluttuazioni della sorgente
Artefatti ed errori sistematici
Specchio semitrasparente
• A carico dello strumento:
95%
– Spettro della sorgente non continuo e/o
fluttuante.
– Luce diffusa dall’ottica, principalmente i
monocromatori (stray light).
Chopper
5%
Riferimento
• A carico del campione
– Effetto di filtro interno (Inner Filter Effect).
– Torbidità.
gs/epb 2004
Spettroscopia di fluorescenza
65
gs/epb 2004
Spettroscopia di fluorescenza
66
11
Correzione per la non linearità della sorgente
Inner Filter Effect
Specchio semitrasparente
95%
Chopper
5%
Campione diluito
A ≤ 0.05
Rodamina
Φf ≈ 1
gs/epb 2004
67
Spettroscopia di fluorescenza
gs/epb 2004
Spettroscopia di fluorescenza
Correzione del Inner Filter Effect
• Diluizione del campione (aumenta la
fluorescenza).
• Correzione della fluorescenza osservata per
l’assorbimento.
Campione concentrato
A > 0.1
68
Torbidità
• Amplifica il Rayleigh scattering, più verso
il blu che verso il rosso.
A(λex) + A(λem)
Fc = Fo * 10
gs/epb 2004
2
69
Spettroscopia di fluorescenza
gs/epb 2004
Determinazione di Φf
• Assoluto
– Sfera di integrazione
• Temperatura:
– Aumenta il fenomeno della conversione interna a causa
dell’aumento dell’agitazione termica: all’aumentare
della temperatura cala Φf.
• Relativo
Φf = Φrif· (Areaf/Arearif) · (Arif/Af) · (η2f/ η2rif)
Dove:
gs/epb 2004
Spettroscopia di fluorescenza
70
Fattori che influenzano Φf
Materiale
riflettente
Φrif = quantum yield del composto di riferimento;
Area = integrale dello spettro di emissione;
A = assorbimento a λex, (< 0.05);
η= indice di rifrazione del mezzo;
Nel caso di proteine si usa come riferimento la
N-acetil-triptofanamide (NATA) Φrif = 0.14.
Spettroscopia di fluorescenza
• Presenza di “quenchers”.
O
NH2
N
H
CH3
– Lo stato eccitato si depopola per vie alternative o non si
forma.
– Stabilizzazione dello stato di tripletto (O2, lantanidi…)
• Lo stato eccitato si depopola via intersystem crossing.
O
N
H
71
gs/epb 2004
Spettroscopia di fluorescenza
72
12
Quenching
Quenching
• Collisionale
– Molecole in soluzione (quenchers) che
reagiscono con lo stato eccitato depopolandolo.
• Non è sempre un fenomeno negativo, può
essere usato come tool per dare
informazioni su:
• Statico
– Struttura di macromolecole.
– Accessibilità al solvente.
– Intorno chimico del fluoroforo.
– Molecole in soluzione che reagiscono con lo
stato fondamentale impedendo il
raggiungimento dello stato eccitato.
gs/epb 2004
73
Spettroscopia di fluorescenza
gs/epb 2004
Quenching collisionale
Φ0 =
kR
kR + ki + 0
; Φ=
Quenching collisionale
• Relazione di Stern-Volmer
kR
kR + ki + kq[Q]
F0/F
Φ0/Φ = 1 + τ0 kq[Q]
τ0/τ
τ0/τ = 1 + τ0 kq[Q]
75
gs/epb 2004
Quenchers “collisionali”
T1 < T2
Spettroscopia di fluorescenza
76
• Reazioni redox allo stato fondamentale.
• Legame di metalli pesanti (Cu++, Ni++,
Co++)
M + hν
M* + Q
T1
Quenchers “statici”
• Depopolano lo stato eccitato attraverso una
cinetica di II ordine:
M*
–
–
–
–
–
–
T2
[Q]
Spettroscopia di fluorescenza
M*
ksv = τ0kq
F0/F = 1 + ksv[Q]
1
Φ0/Φ = τ0/τ
gs/epb 2004
74
Spettroscopia di fluorescenza
M + hν'
M
KI (I-)
Cs+
NO3Acrilamide
Ossigeno
Radicali (nitrossidi)
gs/epb 2004
Spettroscopia di fluorescenza
77
gs/epb 2004
Spettroscopia di fluorescenza
78
13
Quenching statico
• Si forma un complesso allo stato fondamentale
NON è fluorescente.
+Q
Reazioni allo stato eccitato
MQ + hν
M
M*
+ hν
F0/F
(ciò che avviene in un lampo)
τ0/τ
T1 T1 < T2
T2
1
M + hν'
1
[Q]
[Q]
gs/epb 2004
79
Spettroscopia di fluorescenza
Reazioni acido base
Excited state proton transfer
• Il valore di pKa* si ottiene
da:
• Naftolo, fenolo, tirosina, …
OH
*
pKa*
= 2.8
*
O
pKa*= pKa -(hν1-hν2)/2.3RT
+ H+
•
λex = 330 nm
λem = 350 nm
OH
Equazione di Förster
λem = 420 nm
pKa = 9.5
O
+ H+
gs/epb 2004
Spettroscopia di fluorescenza
81
Resonance energy transfer
gs/epb 2004
Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET)
electron transfer
• È il fenomeno
che permette il
trasferimento di
energia da una
molecola allo
stato eccitato
(Donatore) ad
un’altra molecola
(Accettore).
D*
hole transfer
A
D* + - A
DA
hν
D*
D-A+
A
excitation transfer 1 excitation transfer 2
Donatore
(D)
Accettore
(A)
Eccitazione
gs/epb 2004
82
Spettroscopia di fluorescenza
Spettroscopia di fluorescenza
83
gs/epb 2004
D*
DA*
A
D*
DA*
A
Allo stato eccitato
Spettroscopia di fluorescenza
84
14
FRET
• Affinché fra due molecole possa esservi RET (coppia
Donatore-Accettore) devono verificarsi alcune condizioni
descritte dall’equazione di Förster che definisce l’energy
transfer:
WDA = 8.8 ⋅1017 ⋅
I
Assorbimento
Donatore
Fattore di allineamento dipolare
WDA = 8.8 ⋅1017 ⋅
Indice di
rifrazione del
mezzo
k rD κ 2 ε A (ν~ )FD (ν~ )dν~
⋅ ⋅
n4 R6
ν~ 4
Emissione Assorbimento
Donatore
Accettore
FRET
Costante radiativa del
donatore (s-1)
k κ
ε (ν~ )FD (ν~ )dν~
⋅ 6⋅ A
n R
ν~ 4
D
r
4
2
DISTANZA DONATORE ACCETTORE
Emissione
Accettore
I
Assorbimento
Donatore
Emissione Assorbimento
Donatore
Accettore
Emissione
Accettore
Integrale di
sovrapposizione
λ
gs/epb 2004
85
Spettroscopia di fluorescenza
FRET
R0
R
in s -1
1
κ2
• R0 è la distanza alla quale avviene in 50% di FRET.
• Ciò permette di misurare la distanza tra donatore ed accettore
(0-10 nm).
gs/epb 2004
86
• Si misura l’efficienza di FRET:
EDA = 1 – (Fda / Fd); EDA = 1 – (τda / τd)
• Che è legata alla distanza come:
EDA = R06 /(R06 + R6); R= R0(1/EDA – 1)1/6
6
6
ε (ν~ ) ⋅ F (ν~ )
R0 = 8.8 ⋅10 ⋅ 4 ⋅ A ~ 4 D dν~ in Angstrom
n
ν
23
Spettroscopia di fluorescenza
FRET: istruzioni per l’uso
• L’equazione di Förster viene riscritta come:
WDA = k rD
λ
gs/epb 2004
87
Spettroscopia di fluorescenza
• Con: R0= [8.8·1023 k2n-4ΦDJ]1/6 in Å
k = 2/3 (varia da 0 a 4)
n = 1.4 per proteine (varia da 1.33 a 1.6)
Φ D = quantum yield del donatore
J = integrale di sovrapposizione
gs/epb 2004
FRET: utilità
Spettroscopia di fluorescenza
88
Formazione di eccimeri
• In proteine permette di misurare la distanza tra due
siti legando loro una coppia Donatore-Accettore:
Donatore
Accettore
R0 (Å)
Fluoresceina
Tetrametilrodamina
55
5-(2-iodoacetamidoetil)
aminonaftalene-1-solfonato
(IAEDANS)
Fluoresceina
46
5-(2-acetamidoetil)
aminonaftalene-1-solfonato
(EDANS)
4-((4-(dimetilamino)
fenil)azo)benzoato
(DABCYL)
33
• Due o più molecole possono
formare complessi allo stato
eccitato
• Si osserva la formazione di
nuove bande di eccitazione
e/o emissione che non
appartengono ai monomeri
e la cui intensità dipende
dalla concentrazione.
Altre coppie… dal catalogo Molecular Probes http://www.probes.com/
gs/epb 2004
Spettroscopia di fluorescenza
89
gs/epb 2004
Spettroscopia di fluorescenza
90
15
Formazione di eccimeri
La luce polarizzata
• Il pirene in etanolo
forma eccimeri.
• Polarizzazione
verticale
Sorgente
hν
gs/epb 2004
Osservatore
Luce non
polarizzata
• La formazione di
eccimeri è anche
funzione della mobilità
della molecola.
91
Spettroscopia di fluorescenza
La luce polarizzata
Luce polarizzata
verticalmente
gs/epb 2004
92
Spettroscopia di fluorescenza
Anisotropia di fluorescenza
• Polarizzazione
orizzontale
Sorgente
POLARIZZATORE
orientato verticalmente
• Eccitazione con luce polarizzata
z
Analizzatore
I||
Polarizzatore
Osservatore
Luce non
polarizzata
POLARIZZATORE
orientato orizzontalmente
I|
Sorgente
Luce polarizzata
orizzontalmente
gs/epb 2004
x
93
Spettroscopia di fluorescenza
gs/epb 2004
Fotoselezione
• Se si eccita con luce polarizzata verticalmente (z) vengono
eccitate preferenzialmente le molecole il cui dipolo di
assorbimento è parallelo a z.
z
Analizzatore
I||
Analizzatore
I||
x
Rivelatore
Rivelatore
y
gs/epb 2004
Spettroscopia di fluorescenza
I|
φ
Sorgente
x
θ
Polarizzatore
I|
φ
Sorgente
• La frazione di molecole eccitate tra θ, θ + dθ e φ, φ +
dφ è data da: W (θ , ϕ )dθdϕ = (3 / 4π ) cos 2 θ sin θdθdϕ
θ
Polarizzatore
94
Spettroscopia di fluorescenza
Fotoselezione
z
Rivelatore
y
95
gs/epb 2004
Spettroscopia di fluorescenza
y
96
16
Polarizzazione ed anisotropia
z
Valori limite…
z
• Sistema immobile (cristallo) i cui dipoli
sono orientati e paralleli a z:
Analizzatore
I||
Polarizzatore
Polarizzatore
Analizzatore
y
x
x
y
• Polarizzazione p =
• Anisotropia
r=
gs/epb 2004
I|| = 1; I⊥ = 0; r = p = 1
I|
• Sistema immobile (cristallo) i cui dipoli
sono orientati e perpendicolari a z:
y
I|| - I⊥
I|| + I⊥
r=
I|| - I⊥
I|| - I⊥
I|| + 2I⊥
r=
2
3
-1
( 1p - 1 )
3
p = ½; r = 2/5 = 0.4;
I totale
Spettroscopia di fluorescenza
97
… non basta
gs/epb 2004
A cosa può servire la polarizzazione
α
p = ½; r = 2/5 = 0.4;
τf
1 1
1 1
1+ 3
− =
−
p 3
p0 3
φ
• Il tempo di correlazione rotazionale (φ) (il tempo per ruotare di
un angolo il cui coseno sia 1/e, circa 68.5°) è legato alle
dimensioni della molecola (V) alla viscosità (η) e alla
temperatura (T) (Stokes).
Vη
φ=
RT
• Altrimenti:
r = (3 cos2α -1)/5;
• Se α=56° cos2α = 1/3; r = 0
• Quindi:
RT
1 1
=
1 + 3τ f
r r0
Vη
RT
1 1
1 1
− =
−
1 + 3τ f
p 3
p0 3
Vη
56° = angolo magico
Spettroscopia di fluorescenza
99
gs/epb 2004
Dipoli di transizione
• clorofilla a
CH2
H3C
N
H3C
λex = 360 nm
CH3
N
Mg
N
CH3
H
• I valori limite variano in funzione della λex :
O
λex = 250 nm; λem = 400 nm; r = -1/5 = -0.2
λex = 360 nm; λem = 400 nm; r = 2/5 = 0.4
Spettroscopia di fluorescenza
670 nm
CH3
N
λem = 400 nm
gs/epb 2004
100
Spettroscopia di fluorescenza
Dipoli di transizione
• Per alcune molecole esistono più dipoli di
transizione (assorbimento e/o emissione), per
esempio l’antracene:
λex = 250 nm
98
Spettroscopia di fluorescenza
• Determinare le dimensioni di una macromolecola (Perrin):
• Sistema immobile i cui dipoli
non sono orientati (vetro) ed il
dipolo della transizione di
assorbimento è parallelo al
dipolo della transizione di
eccitazione:
gs/epb 2004
I|| = 0; I⊥ = 1; r = - ½; p = -1;
• Sistema immobile i cui dipoli non sono
orientati (vetro):
O
O
630 nm
CH3
O
O
CH3
CH3
101
gs/epb 2004
Spettroscopia di fluorescenza
CH3
CH3
CH3
102
17
Geometria a T (strumento ideale)
Luce polarizzata
verticalmente
Geometria a L
Luce polarizzata
verticalmente
I||
Luce non
polarizzata
Luce non
polarizzata
Analizzatore
verticale
Campione
Campione
Analizzatore
orizzontale
Sorgente
Analizzatore
verticale
Sorgente
Polarizzatore
verticale
Polarizzatore
verticale
I||
I⊥
gs/epb 2004
103
Spettroscopia di fluorescenza
gs/epb 2004
Geometria a L
Determinazione di r (p)
Luce polarizzata
verticalmente
• Si fanno le misure di intensità con
eccitazione verticale ed emissione verticale
I|| - I⊥
ed orizzontale:
Luce non
polarizzata
r=
Campione
Sorgente
Polarizzatore
verticale
I⊥
O
NH3 +
Triptofano (W)
Tyrosina (Y)
CH2
CH3
N
N
H3C
N
N
N
HO
O
O
N
H
O
P O
OH
N
HO
Clorofilla a
CH3
HO
NH3+
O
– Può esistere come tirosinato.
– Può dare energy transfer con il triptofano (difficile).
• Fenilalanina
– Per fanatici.
CH3
Spettroscopia di fluorescenza
O
O
NH3+
• Tirosina
OH
NADH
CH3
NH3+
– Il più efficiente ed il più usato,
– A secondo del suo intorno chimico varia il suo spettro.
N
O
CH3
CH3
106
• Triptofano
N
CH3
O
O
gs/epb 2004
OH
I|| - I⊥·G
I|| + 2I⊥·G
O
O
N
O
O P O
OH
O
CH3
H
O
O
NH2
H H NH2
O
Mg
r=
I||0
Spettroscopia di fluorescenza
O
Fenilalanina (P)
CH3
I⊥ 0
Fluorescenza intrinseca di proteine
NH3+
NH3+
HO
gs/epb 2004
O
O
O
H3C
105
Fluorofori intrinseci
O
N
H
G=
Spettroscopia di fluorescenza
I|| + 2I⊥
• Occorre determinate il “G factor” (G =
grating) attraverso l’eccitazione orizzontale.
Analizzatore
orizzontale
gs/epb 2004
104
Spettroscopia di fluorescenza
107
gs/epb 2004
Spettroscopia di fluorescenza
108
18
Fluorescenza intrinseca di proteine
Fluorescenza intrinseca di proteine
• Spettri di assorbimento
• Spettro di eccitazione del
Trp (λem = 350 nm)
• Spettro di emissione del Trp (λex = 295 nm)
in soluzione acquosa a temperature variabili.
Intensità di Fluorescenza (U.A.)
14000
12000
10000
8000
6000
4000
2000
0
220
240
260
280
300
320
λ (nm)
gs/epb 2004
109
Spettroscopia di fluorescenza
gs/epb 2004
Sonde fluorescenti per proteine
• Dansile (e derivati: EDANS;
IAEDANS)
– Usato per fare il “labelling”
covalente di proteine al gruppo
amminico;
– Usati per FRET;
• ANS
– Usato per studiare il “molten
globule state”. Si lega in modo
non covalente preferibilmente
ai domini idrofobici delle
proteine.
– In ambiente idrofobico è più
fluorescente che in acqua.
gs/epb 2004
H 3C
N
Sonde fluorescenti per FRET
HO
CH3
O
• Fluoresceina e rodamina
O
– Sono usate come
accettori, o come coppia
donatore/accettore, in
esperimenti di FET.
COOH
SO2Cl
H3C
H3C
N
O
CH3
N
+
COOH
CH3
H
SO3- N
111
Spettroscopia di fluorescenza
gs/epb 2004
Sonde fluorescenti per acidi nucleici
• Intercalanti
– Etidio bromuro (propidio
ioduro)
– DAPI
Spettroscopia di fluorescenza
• Di pH: Arancio di acridina
H3C
N
CH3
N
CH3
N
CH3
NH2
+
Br-
NH2
CH3
gs/epb 2004
H2N
NH
N
H
Spettroscopia di fluorescenza
112
Indicatori fluorescenti
H2N
N
110
Spettroscopia di fluorescenza
• Di excited state proton
transfer: Naftolo
NH
113
gs/epb 2004
Spettroscopia di fluorescenza
OH
114
19
Fluorescenza di membrane
Sonde fluorescenti di membrana
• Le membrane non sono fluorescenti: servono
delle sonde:
H3C
+
H3C N CH3
R
O
DPH
R=
H
CH3
+
N
CH
CH 3
TMA-DPH R =
O
O
3
O
R
O
O
PA-DPH
R=
O
O
O P O
O
O
R
HO
O
R
R
CH3
Antranildervati di acidi grassi
Perilene
Pirene
H3C
Fosfatidilcolina-DPH
gs/epb 2004
Spettroscopia di fluorescenza
115
gs/epb 2004
116
Spettroscopia di fluorescenza
Le sonde di membrana
…che hanno localizzazioni più o meno “certe”
• Si usano per misure di anisotropia di fluorescenza e danno
informazioni sulla “fluidità” della membrana.
H3 C CH
3
+
H3 C
N
O OH
H3 C +
H3 C N CH3
O
O
OPO
O
O O
O
O
O
O O
O
O
O
O
O O
O
O
O
O
O
O
CH 3
CH 3
CH 3
CH 3
H3C
gs/epb 2004
Spettroscopia di fluorescenza
117
gs/epb 2004
Sonde per ioni metallici
Sonde per il calcio
O
H3C O
• Solo alcuni metalli sono fluorescenti
(lantanidi).
• In genere i metalli sono “quenchers” perché
depopolano lo stato eccitato attraverso
meccanismi di trasferimento di carica (Cu2+,
Co2+, Ni2+).
• I metalli come il Ca2+ hanno bisogno di
sonde.
gs/epb 2004
Spettroscopia di fluorescenza
118
Spettroscopia di fluorescenza
119
O
O
O
O
O
N
N
O
O
O
O
CH 3
FURA-2
QUIN-2
I generazione
8-amino-2-[(2-amino-5-metilfenossi)
metil] -6- metossichimolinaN,N,N'
,N'
-tetraacetato
gs/epb 2004
O
N
N
O
CH 3
O
O
O
N
O
O
O
O
O
O
N
O
O
II generazione
1-[6-amino-2-(5-carbossi-2-ossazolil)5-benzofuranilossi]- 2-(2-amino-5metilfenossi) etano-N,N,N'
,N'
tetraacetato
Spettroscopia di fluorescenza
120
20
Fluorescenza “dinamica”
• Teoria
• Strumentazione
FURA-2
– Sorgenti e rivelatori
• Decadimento di fluorescenza.
– Determinazione e significato di τi e ai
• Decadimento dell’anisotropia
– Determinazione e significato di φi, bi, r0 e r∞
gs/epb 2004
Spettroscopia di fluorescenza
121
gs/epb 2004
Spettroscopia di fluorescenza
122
…e poi
• FRAP (fluorescence recovery after
photobleaching);
• TPE (two photons excitation);
• CLSM (confocal laser scanning
microscopy)
• Citometria a flusso.
gs/epb 2004
Spettroscopia di fluorescenza
Fine …
…per ora!
123
21