Biochimica II Fluorescenza

FLUORESCENZA
1.
2.
3.
Emissione di radiazioni di una molecola che torna
allo stato fondamentale da uno stato elettronico
eccitato
L’emissione è spostata verso il rosso rispetto alla
eccitazione (= lunghezza d’onda maggiore).
Si possono misurare i seguenti parametri:
a.
b.
c.
d.
Spettri di eccitazione ed emissione
Intensità di fluorescenza
Tempo di emivita
Polarizzazione
Intensità di fluorescenza, If e misure di concentrazioni
If = 2.3 I0 ε d c Φf
Φ f = resa quantica =
0 ≤ Φ ≤1
fotoni emessi
fotonia assorbiti
Relazione tra concentrazione e
fluorescenza
smorzamento (quenching)
(ioni Cu++, Ni++, Co++)
Identikit di molecola fluorescente
1. deve avere uno spettro di assorbimento (un
elettrone n o π che raggiunga uno stato eccitato)
2. lo stato eccitato deve avere un tempo di vita
3. deve essere una molecola planare
4. la molecola è aromatica
Biomolecole fluorescenti:
O
O
H2N
CH C
H2N
OH
CH C
O
OH
CH2
CH2
H2N
CH C
OH
CH2
HN
OH
triptofano
tirosina
NH2
H2 N
O
fenilanina
N
C
NH
O
O
H
H
OH
H
H
OH
NADH
P
O-
N
O
O
O
P
O
N
N
clorofilla
O
OH
H
H
OH
H
OH
beta-carotene
porfirine
Diagramma di uno spettrofotofluorimetro
Sorgente
Σλex
Monocromatore di
eccitazione
λex
campione
Σλem
λem
Monocromatore di
emissione
Rivelatore
devono essere contenuti in
Effetti pre-filtro e postfiltro
pre
post
microcuvetta
pre = assorbimento luce incidente
post = assorbimento luce emessa
Entrambi i casi si risolvono diluendo il campione o
utilizzando microcuvette
Fluorimetri per micropiastre
tempi di lettura:
96 pozzetti in 15s
limiti di rilevazione:
10 aM
lampada
allo xenon
(flash lamp)
Principali applicazioni della
fluorescenza
1.
2.
3.
Misure di spettri
Analisi qualitative (immunofluorescenza)
Analisi quantitative
a.
b.
c.
4.
5.
6.
7.
Dosaggi enzimatici
legame con recettori
legame con anticorpi (DELFIA)
Studi di struttura e funzione delle proteine
mediante trasferimento di energia (FRET)
Misure di “quenching”
Sonde fluorescenti e struttura/viscosità delle
membrane
Biosensori
Spettri in soluzione
spettro di eccitazione: scansione del monocromatore
di eccitazione – fissa lunghezza d’onda di emissione
spettro di emissione: scansione del monocromatore
di emissione – fissa lunghezza d’onda di eccitazione
monocromatore = selettore di lunghezza d’onda
L’emissione di luce fluorescente avviene secondo uno spettro di
energie e a lunghezza d’onda maggiore di quella di eccitazione
La differenza di energia tra i picchi massimi è detta spostamento di
Stokes
spostamento di Stokes = 25 nm
495 nm
Fluorescenza
Fluoresceina
lunghezza d’onda
520 nm
1.
Lo spettro di emissione e la λmax non dipendono dalla λecc
2.
La intensità di fluorescenza dipende dalla λecc
Dosaggio della fosfatasi alcalina
CH3
CH3
O
O
O
O
P
OH
OH
metilumbelliferone-fosfato
OH-
+ fosfato
O
O
OH
metilumbelliferone
si segue il decorso della reazione eccitando a 365 nm
e misurando la fluorescenza a 450 nm
Fluorescent Proximity Assay
peptide con quenciante (Qu)
Qu
Qu
PO4
Ga3+
Ga3+
ATP
Ga
Ga3+
Qu
3+
O4P
Ga3+
ADP
3+
Ga
Saggio per chinasi e fosfatasi
1. Si basa su microsfere rivestite di polimeri fluorescenti e un metallo
(gallio) in grado di chelare il fosfato.
2. I substrati sono marcati con un agente smorzante (quencher).
3. Se il peptide è fosforilato si lega alle sferette.
4. Si possono saggiare inibitori (farmaci)
5. valido per screening e sistemi automatizzati
Fluorescenza dei lantanidi (europio, samario, terbio, disprosio)
Chelato
Excit.
(nm)
Emission
(nm)
Fluorescenza
vita media (τ)
(µsec)
Suggested
Emission Filter
Europium (Eu)
340
615
730
620/40
Samarium (Sm)
340
642
50
645/40
Terbium (Tb)
320
545
1050
545/40
*(Dyprosium (Dy)
320
572
16
575/15
eccitamento mediato da composti
organici chelanti
europio
Time-resolved fluorescence
Strumentazione: fluorimetro con lampada allo xenon
che produce un flash di 2-5 μsec
Misure: composti con vita di fluorescenza > 20 μsec
DELFIA, Delayed Enhanced Lanthanide Fluorescence Immuno Assay
Anticorpi:
Si usano anticorpi chelati con Eu3+
mediante agenti alchilanti come l’ ITCDTPA, acido 1-(p-isotiocianatobenzil)
dietilentriamina pentacetico, che reagisce
facilmente con i gruppi aminici delle
proteine.
Incubazione: pH 3.2
(dissociante) + dichetone
per la cattura del lantanide
Fluorescenza per Trasferimento di Energia per
Risonanza (FRET)
Sovrapposizione degli spettri di donatore ed accettore
Molecola 1
Molecola 2
Fluorescenza
Intensità
Fluorescenza
DONATORE
ACCETTORE
Assorbimento
Assorbimento
Lunghezza d’onda
Equazione di forster
Principali applicazioni della FRET
1.
2.
3.
4.
Cambiamenti conformazionali di proteine
Interazioni proteina-proteina
Dosaggi di attività enzimatiche
Interazioni DNA-DNA (sonde e biosensori)
FRET con proteine fluorescenti
Aequorea victoria
GFP, Green Fluorescent Protein
Caratteristiche della GFP
a. 238 aa, PM 27kDa. Cristallizza
come dimero.
b. Eccitazione a 395 e 470 nm (resa
quantica = 0.8)
c. Emissione a 509 nm
d. Utilizzata come gene reporter in
Biologia Molecolare
e. Utilizzata in dosaggi enzimatici.
Non richiede l’aggiunta di substrati
Varianti della GFP prodotte per ingegneria genetica
gruppo
fluoroforo
YFP = Ala206 sostituita da una lisina
Ala206
proteina di fusione
GFP
gene di fusione
per proteina ibrida
Saggio di proteine chinasi con FRET
sequenza consenso
riconosciuta dalla PKA
dominio di legame della
fosfatidilserina
IFP
Interazioni DNA-DNA (sonde e biosensori)
FRET
no FRET
Sensore per AMP ciclico (cAMP)
1. generato per fusione genetica di eBFP (variante della GFP che
emette luce blu) alla subunità regulatoria (R) della PKA ed eGFP
(variante della GFP che emette luce verde) alla subunità catalitica
(C) della PKA.
2. In condizioni di basso cAMP i due fluorofori sono molto vicini e se
eccitati a 380 nm solo una parte della luce è emessa come blu
mentre il resto è trasferito alla eGFP (FRET), che quindi emette
luce verde.
3. Se il cAMP si lega alla subunità R, la variazione conformazionale
abolisce la FRET poiché i due fluorofori sono separati. Allora,
l’eccitazione a 380 nm dà solo luce blu. Le subunità PKA R e C
sono rispettivamente in giallo e arancio
DCFH-DA
DCFH
DCF
2’,7’-diclorofluorescina diacetato
O
O
CH3-C-O
O
O-C-CH3
Cl
Cl
2’,7’-diclorofluorescina
H
COOH
O
HO
Cl
Esterasi
cellulari
OH
Cl
H
COOH
2’,7’-diclorofluoresceina
O
HO
Idrolisi
DCFH-DA
O
H2O2
Cl
Ossidazione
Cl
H
COOH
DCFH-DA
DCFH
DCF
H2O2
Fluorescente
Fluorescence Recovery After Photobleaching
(FRAP)
Si usa una energia intensa (laser) per esaurire
un fluoroforo
Cellule muscolari embrionali in coltura
Osservare la zona “buia” (foto-sbiancata)
nel tempo...
La fluorescenza ricompare nella regione “sbiancata”