tempi di vita File - e

spettroscopia di
assorbimento e fluorescenza
laura d’alfonso @ Unimib
assorbimento e colori
assorbimento molecolare
una molecola può assorbire
una radiazione (l) solo se nella molecola
esiste una transizione di corrispondente energia
E  h 
hc
l
c = 3x108 m/sec
h = 6.63x10-34 Jsec
la radiazione elettromagnetica
pigmenti naturali
la legge di Beer - Lambert
I0
1.4
sostanza
1.2
concentrazione c
1.0
assorbanza
cammino ottico l
0.8
I
trasmittanz a T 
I
I0
I
A  - logT  log   cl
 I0 
deviazioni:
0.6
• variazioni dei coefficienti di assorbimento ad alte concentrazioni (>10mM)
0.4 interazioni elettrostatiche tra molecole vicine;
a causa delle
• scattering di luce (torbidità, particelle in sospensione, ~ 1/l4);
0.2
• contributi di fluorescenza o fosforescenza;
• variazioni di
0.0 indice di rifrazione ad alta concentrazione;
250
300
350
400
450
500
• spostamento degli equilibri chimici in funzione della concentrazione;
lunghezza
d'onda
• contributi non monocromaticità
(più affidabile
il massimo della banda);
• luce di fondo.
strumentazione
Assorbanza (A)
A = log10 (I0/I)
A=3 I0 = 1000 I
A=2 I0 = 100 I
A=1 I0 = 10 I
% Transmission (%T)
%T = I/Io
A = log10 (1/T)
significato fisico
I0
Iz
z
A
dx
I-dI
I
N = c NAV /1000 = molecole/cm3
s = sezione d’urto
dI  I s N dx
l
ln I  ln I0   s N l
I
 ln   s N l  s (NAV /1000) c l
 I0 
I
- log   s (NAV /1000)/2.303 c l
 I0 
  s (NAV /1000)/2.303
I
I
 ln   - 2.303log 
 I0 
 I0 
I
- log   A   c l
 I0 

s
(cm2)
(M-1cm-1)
10-12
3x108
molecole
10-16
3x104
infrarosso
10-19
3x10
10-29
3x109
assorbimento atomi
scattering Raman
assorbimento multi-fotoni
s2 ÷ s1 Dx Dt
Dx ≈ s1 ≈ 10-17–10-16 cm2
Dt ≈ 10-16 sec
sn ÷ s1n Dtn-1
10-84 cm6sec2
www.drbio.cornell.edu/MPE
1 GM = 10-50 cm4sec
sonde convenzionali
alcune sezioni d’urto
a 2 fotonisezione d’urto a due fotoni
indicatori del calcio
il picco di assorbimento si trova
spesso ad una l doppia rispetto al
picco a singolo fotone..
.. e spesso no!
es.: rodamina
es.: cumarina
assorbimento
singolo fotone
(asse x per 2)
probabilità
assorbimento
2 fotoni
proteine fluorescenti
responsabili assorbimento nelle proteine..
1. alfa elica
2. random
(pH 11, 25°C)
(pH 6, 25°C)
3. beta sheet (pH 11, 52°C)
Wavelength (nm)
Wavelength (Å)
.. e negli acidi nucleici
analisi della reattivita’ dei gruppi SH via DTNB
mioglobina
5,5-Dithiobis(2-nitrobenzoic acid)
TNB carbossilato 420 = 190 mM-1 cm-1
neuroglobina umana
citoglobina umana
citoglobina zebrafish
TNB anione 412 =13.6 mM-1 cm-1
TNBS-STNB+SCys
 STNB+TNBS-SCys
D. Hamdane et al, J. BIOL. CHEM Vol. 278, No. 51, pp. 51713–51721, 2003
fluorescenza di biomolecole
fotone
molecola nello
stato fondamentale
fotone
molecola nello
stato eccitato
la luce puo’ indurre transizioni
tra gli stati elettronici di una molecola
diagramma di Jablonski
assorbimento 10-15 s
fluorescenza 10-12-10-7 s
fosforescenza 10-2-101 s

kR
kR

kR  kic  kci  kq (Q) kR  kNR
Stokes shift
l’emissione avviene sempre dal più basso
stato vibrazionale di S1 (conversione interna)
regola dello specchio
lo spettro di emissione
è un’immagine speculare
dello spettro di assorbimento
i livelli S0 e S1 presentano
strutture vibrazionali simili
regola di Kasha
lo spettro di fluorescenza
è indipendente dalla
lunghezza d’onda di eccitazione
…
kR
kR



1
kR  kNR R
  f(l)  d
F(l)  Pabs  Pem
I0  I
I  I0e
2.303( l abs )Cl
se Cl < 0.05
I  I0 1  2.303(l ab s )Cl
lineare
nella
concentrazione
I0  I  2.303(l ab s )ClI0
F(l)  (l abs )    f(l)  C  I0  K
non è una misura assoluta
strumentazione
parametri sperimentali
lampada appropriata
per l’intervallo di lunghezze d’onda
di interesse
correzione per
lo spettro
della lampada
parametri sperimentali
ampiezza fenditure monocromatore
risoluzione spettrale
scelta accurata dei filtri
di eccitazione ed emissione
proprietà misurabili con la fluorescenza
• spettri (effetti circondario)
• tempi di vita della fluorescenza
• polarizzazione (orientazione e dinamica)
• trasferimento eccitazione
(distanze -> dinamiche)
• localizzazione della fluorescenza
fluorofori: intrinseci o sintetici?
fluorofori intrinseci
fenilalanina
tirosina
triptofano
studio del folding
1.
2.
3.
4.
apoazurin
ribonuclease T1
staphylococcal nuclease
glucagon
Eftink MR, Methods Biochem Anal, 1990.
mutazioni tyr-trp
lactate dehydrogenase
Smith CJ et al., Biochemistry, 1991.
trp
acidic residues
hydrophobic res
human antithrombin
PGW Gettings, Univ Illinois
Mehager JL et al., J Biol Chem, 1998.
fluorofori estrinseci
eccitazione 1 vs 2 fotoni
Xu C et al., PNAS USA, 1996.
eccitazione simultanea
Xu C et al., PNAS USA, 1996.
fluorofori sintetici
la famiglia “Alexa”..
..fluorofori per tutti i gusti!
la famiglia “Cy..”
titolazione raziometrica del calcio
fluorofori sensibili al pH
sonda
eccitazione
emissione
riconoscere i componenti cellulari..
Alexa 488 - actin (Ar ion 488 line)
Texas Red-X - lectin ( green helium-neon 543 line)
Hoechst 33342 - nucleus. (violet diode 405 line)
Rat Diaphragm Smooth Muscle Tissue
Alexa 568 - vimentin intermediate filament
Alexa 488 - glial fibrillary acidic protein
DRAQ5 - nucleus
Rat Brain Hippocampus Sagittal Thin (8-Micrometer) Section
Alexa 568 - tubulin
SYTOX Green - nucleus
Alexa 350 - actin
Adherent Rat Thoracic Aorta Smooth Muscle Cell
Cy2 - cytokeratin
MitoTracker Red CMXRos - mitochondrial network
DAPI - nucleus
Adherent Rat Kangaroo Kidney Epithelial Cell
Alexa Fluor 488 - actin
MitoTracker Red CMXRos - mitochondria
Hoechst 33342 - nucleus
Adherent Normal Tahr Ovary (HJ1.Ov) Epithelial Cell
proteine fluorescenti
Opossum Kidney Cortex Epithelial Cells (OK Line)
Human Cervical Adenocarcinoma Cells (HeLa Line)