Il lisozima ritarda nei rossi e blocca nei bianchi la malolattica
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Il lisozima ritarda nei rossi e blocca nei bianchi la malolattica
TECNICA ENOLOGIA T • A B B AT T E R E L A M I C R O F L O R A L AT T I C A S P O N TA N E A N E L M O S T O E N E L V I N O Il lisozima ritarda nei rossi e blocca nei bianchi la malolattica ▪ I risultati hanno evidenziato la diversa efficienza del lisozima sulla microflora lattica spontanea durante la vinificazione. Nel vino rosso (Valpolicella) l’effetto dell’enzima è stato parziale, ritardando solamente la fermentazione malolattica, mentre in quello bianco (Soave) ha inibito completamente lo sviluppo dei batteri indigeni ▪ di E. Tosi, M. Azzolini, M. Cristofoletti, G. Zapparoli I l lisozima è un agente antimicrobico che, ormai da oltre un decennio, è utilizzato con sempre più frequenza nelle cantine per il controllo delle popolazioni di batteri lattici (Amati et al., 1994; Gao et al., 2002). La selettività di questo composto, a differenza della SO2, è derivata dalla sua azione specifica sulla parete cellulare dei batteri gram-positivi, quali appunto i batteri lattici. Vari studi sono stati svolti per determinarne le condizioni ottimali di somministrazione. Ad esempio è stata valutata l’influenza che le varie componenti del mosto e del vino, quali i solidi sospesi, le sostanze colloidali e i polifeno- li, esercitano sulla sua attività (Eggert et al., 2006). Anche il pH riveste una certa importanza per il lisozima in quanto una bassa acidità ne aumenta l’efficacia, pertanto il suo utilizzo permette un significativo controllo di batteri lattici indesiderati che crescono con più facilità a pH alti (Amati et al., 1994). La componente polifenolica interferisce, invece, negativamente sull’attività del lisozima per cui nei vini rossi la sua azione è meno duratura che non nei vini bianchi in seguito alla nota capacità che le molecole polifenoliche hanno di aggregare le proteine, come il lisozima. Altri studi sono stati effettuati per valutare gli effetti del lisozima sulla composizione chimica e sensoriale dei vini Le dosi impiegate di lisozima sono state di 150 e 300 mg/L aggiunte al mosto e in coda alla fermentazione in vino Valpolicella e Soave (Bartowsky et al., 2004). Da un punto di vista pratico il lisozima ha trovato applicazione con successo in differenti fasi della vinificazione a partire dall’ammostatura, prima o dopo la fermentazione alcolica e dopo la fermentazione malolattica per stabilizzare il prodotto (Gerbaux et al., 1997). Tuttavia le attuali conoscenze, relative ai meccanismi di azione e alle modalità di impiego del lisozima, non si possono considerare esaurienti. L’efficacia del lisozima è legata alle molteplici variabili che intervengono in un processo di vinificazione e a seconda delle condizioni enologiche il suo effetto può essere differente. Considerando che l’uso di un additivo ha un costo, la scelta di impiegare o meno il lisozima è legata al valore economico del vino da produrre, oltre che alla sua effettiva capacità di controllare la crescita dei batteri lattici nella vinificazione. È importante, quindi, continuare la sperimentazione allo scopo di migliorare le conoscenze di questo aspetto applicativo dell’enologia. Obiettivo In questo studio è stata valutata l’azione del lisozima, utilizzato in due momenti e con due dosaggi diversi, nel mosto e in prossimità della fine della fermentazione alcolica, durante due differenti vinificazioni, una in rosso e l’altra in bianco. I dati analitici dei vini sono stati correlati con il monitoraggio della popolazione lattica indigena e dell’acido malico da essa consumata. Infine, tesi trattate con il lisozima sono state successivamente inoculate con starter batterici per valutare la possibilità di ottenere fermentazioni malolattiche controllate. Le prove condotte Microvinificazioni. Le vinificazioni in rosso (vino Valpolicella) e in bianco (vino Soave) sono state condotte in cantina secondo i rispettivi disciplinari 22/2008 • L’Informatore Agrario 55 TECNICA ENOLOGIA dei mosti utilizzati per la produzione di vino Valpolicella e Soave Parametri Valpolicella pH Acidità totale (g/L) (*) Zuccheri ferment. (°Brix) Acido malico (g/L) Acido L-lattico (g/L) Acido acetico (g/L) Batteri lattici (Ufc/mL) Soave 3,29 3,51 5,98 5,30 20,62 20,87 1,58 1,91 0,05 0,04 0,09 0,03 1,5 × 104 7,0 × 104 (*) In acido tartarico. TABELLA 2 - Polifenoli, antociani e tannini totali nel mosto e nel vino Valpolicella al momento dell’aggiunta di lisozima Parametri Polifenoli totali (mg/L) (2) Antociani totali (mg/L) Tannini totali (g/L) (3) Mosto Vino (1) 1.078 1.331 180 316 1,86 2,20 (1) Prima del termine della fermentazione alcolica con residuo zuccherino di circa 15 g/L. (2) In acido gallico. (3) Malvina cloroidrato. A - Lisozima all’ammostatura 8 7 6 5 4 3 2 1 0 0 5 10 15 20 Giorni 150 mg/L 25 30 Popolazione batterica (Log Ufc/mL) TABELLA 1 - Composizione Popolazione batterica (Log Ufc/mL) T 35 L’Informatore Agrario • 22/2008 0 5 10 150 mg/L + starter 300 mg/L Senza lisozima (tesi di controllo) 15 20 25 30 Giorni 300 mg/L + starter 35 (*) Le linee tratteggiate indicano le conte dei batteri nelle tesi inoculate con colture starter dopo la fermentazione alcolica. GRAFICO 1 - Andamento della popolazione batterica indigena nelle tesi di vino Valpolicella addizionate di lisozima all’ammostatura (A) e in coda alla fermentazione alcolica (B) e nella tesi di controllo (*) Nel mosto le due concentrazioni di 150 e 300 mg/L di lisozima hanno determinato un momentaneo abbattimento della microflora lattica, che però ha avuto una durata limitata (A). Dopo due giorni si è verificata una rapida ricrescita della popolazione in tutte le tesi trattate con lisozima. Un comportamento analogo si è registrato quando l’enzima è stato aggiunto in coda alla fermentazione alcolica (B). Impiego del lisozima. È stato impiegato un preparato commerciale di lisozima con attività dichiarata di 26.000 UFC/g di produzione, in volumi di 100 L in tini sciogliendolo prima in acqua. Poi lo si è di acciaio della capacità di 150 L. addizionato nella massa vinaria che è stata Per la produzione di vino Valpolicella, agitata vigorosamente per favorirne una all’ammostatura dell’uva il mosto è sta- rapida e omogenea distribuzione. Le doto separato dalle vinacce e, dopo essere si impiegate sono state di 150 e 300 mg/L state ben mescolate, le due frazioni liqui- aggiunte al mosto o in coda alla fermende e solide sono state suddivise in modo tazione quando la concentrazione degli omogeneo per la costituzione di singole zuccheri residui era di circa 15 g/L. tesi confrontabili. Prima dell’inoculo dei Analisi chimiche e microbiololieviti starter la massa vinaria è stata sol- giche. Le analisi chimiche sui mosti fitata alla concentrazione di 50 mg/L di e sui vini hanno riguardato: etanolo ed SO2 per controllare la miestratto secco determinacroflora indigena e consenti mediante spettrofototire un corretto avvio della metro con sistema NIR, Il lisozima ha inibito fermentazione alcolica. acidi organici per via enla fermentazione La fermentazione alcolizimatica, SO2, acidità tomalolattica spontanea ca è stata seguita monitotale e zuccheri per titolanel vino bianco Soave rando il consumo di zuczioni seguendo i protocheri fermentescibili e la colli standard. Le conte produzione di etanolo. Al dei batteri sono state eftermine di questa si è proceduto alla svi- fettuate piastrando diluizioni decimali natura e successiva sfecciatura nel caso di campioni di mosto-vino in terreno del Valpolicella e alla sola sfecciatura nel di coltura MRS con il 10% di succo di vino Soave. pomodoro; le piastre sono state incuDurante la fermentazione alcolica e bate a 28 °C per 7 giorni in anaerobioquella malolattica (FML) sono stati rac- si. La fermentazione malolattica è stata colti i campioni per le analisi chimiche considerata completata quando il cone microbiologiche. tenuto in acido malico risultava infeAl termine della fermentazione alcoli- riore a 0,10 g/L. ca, dopo la svinatura e sfecciatura, sono Mosti. La tabella 1 mostra la composistati aggiunti batteri malolattici starter zione dei mosti utilizzati per la sperimendella specie Oenococcus oeni in frazio- tazione all’inoculo dei lieviti starter. ni di tesi già addizionate di lisozima nel Al momento dell’analisi i mosti erano mosto o prima della fine della fermen- stati solfitati e la concentrazione di SO2 tazione alcolica. era di circa 50 e 10 mg/L come totale e 56 B - Lisozima dopo fermentazione alcolica 8 7 6 5 4 3 2 1 0 libera, rispettivamente. Queste concentrazioni non sono limitanti la crescita dei batteri lattici. Vinificazione in rosso Data la possibile interferenza dei polifenoli del vino sull’attività del lisozima, è stato determinato il contenuto polifenolico del mosto e del vino al momento dell’aggiunta dell’enzima (tabella 2). Nei vini Soave è stata riscontrata una drastica riduzione della popolazione batterica sia con l’aggiunta del lisozima nel mosto sia in coda alla fermentazione 1,8 1,6 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 0 5 10 150 mg/L 300 mg/L 15 20 25 30 35 Giorni 150 mg/L in coda FA 300 mg/L in coda FA Senza lisozima (tesi di controllo) (*) Addizionate di lisozima all’ammostatura e in coda alla fermentazione alcolica e nella tesi di controllo. GRAFICO 2 - Degradazione dell’acido malico nelle tesi di vino Valpolicella (*) L’addizione di 150 mg/L di lisozima nel mosto non ha sortito praticamente nessun effetto ritardante, mentre in dose doppia si è osservato un posticipo del termine della fermentazione malolattica di circa 10 giorni rispetto alla tesi di controllo. TABELLA 3 - Analisi dei vini Valpolicella dopo la fermentazione malolattica senza o con l’impiego di lisozima (1) Senza Con lisozima (mg/L) Parametri lisomosto vino (2) zima 150 300 150 300 pH 3,53 3,53 3,49 3,53 3,53 Etanolo (% vol.) 11,90 11,76 11,88 11,85 11,92 Zuccheri residui (g/L) 3,16 2,75 2,84 2,76 3,32 Estratto totale (g/L) 28,8 28,9 29,0 29,2 28,9 Acidità totale 6,00 5,85 6,15 6,06 5,95 (g/L) (3) Acido L-lattico (g/L) 1,34 0,93 1,12 1,08 1,15 Acido acetico (g/L) 0,26 0,27 0,26 0,24 0,23 (1) Alla concentrazione di 150 e 300 mg/L nel mosto e in coda alla fermentazione alcolica. (2) Prima del termine della fermentazione alcolica con residuo zuccherino di circa 15 g/L. (3) In acido tartarico. I vini Valpolicella trattati o meno con lisozima hanno mostrato al termine della fermentazione malolattica composizioni non dissimili. Nel mosto le due concentrazioni di 150 e 300 mg/L di lisozima hanno determinato un momentaneo abbattimento della microflora lattica, che però ha avuto limitata durata (grafico 1 A). Dopo due giorni si è verificata una rapida ricrescita della popolazione in tutte le tesi trattate con il lisozima. Un comportamento analogo si è registrato quando l’enzima è stato aggiunto in co- da alla fermentazione alcolica (grafico 1 B). L’osservazione delle cinetiche di degradazione dell’acido malico, misurate nelle tesi, ha permesso di valutare il contributo del lisozima in termini di ritardo della fermentazione malolattica spontanea rispetto alle tesi di vino nelle quali l’enzima non è stato aggiunto (tesi di controllo) (grafico 2). L’addizione di 150 mg/L di lisozima nel mosto non ha sortito praticamente nessun effetto ritardante, mentre in dose doppia si è osservato un posticipo del termine della fermentazione malolattica di circa 10 giorni rispetto alla tesi di controllo. Nelle tesi nelle quali il lisozima è stato aggiunto in coda alla fermentazione alcolica, con 150 mg/L non si è osservata nessuna differenza rispetto al controllo, mentre con dose doppia il ritardo del termine della fermenatazione malolattica è stato modesto (circa 2 giorni) rispetto al controllo. I vini Valpolicella ottenuti dalle tesi trattate e non con il lisozima hanno mostrato al termine della fermentazione malolattica una composizione sostanzialmente non dissimile tra loro (tabella 3). ENOLOGIA Popolazione batterica (log UFC/mL) Degradazione acido malico (g/L) TECNICA T 7 6 5 4 3 2 1 0 0 5 150 mg/L 300 mg/L 10 15 20 25 Giorni 150 mg/L in coda FA 300 mg/L in coda FA Senza lisozima (tesi di controllo) (*) Addizionate di lisozima all’ammostatura e in coda alla fermentazione alcolica e nella tesi di controllo. GRAFICO 3 - Popolazione batterica indigena nelle tesi di vino Soave (*) Si è osservata una drastica riduzione della popolazione batterica sia con l’aggiunta del lisozima nel mosto sia in coda alla fermentazione alcolica con entrambi i dosaggi. Si è osservata una drastica riduzione della popolazione batterica sia con l’aggiunta del lisozima nel mosto sia in coda alla fermentazione alcolica con entrambi i dosaggi (grafico 3). La concentrazione dei batteri lattici è rimasta contenuta per tutta la durata della sperimentazione in tutte le tesi. L’abbattimento della popolazione indigena è stato di simile entità sia con dosi di 150 sia con 300 mg/L di lisozima. Con questo effetto la malolattica spontanea è stata impedita, mentre nella tesi senza lisozima si è completata dopo 25 giorni dall’ammostatura (grafico 4). Nella tabella 4 sono riportate le composizioni dei vini al termine della sperimentazione e le differenze tra controllo e tesi trattate con lisozima sono dovute principalmente all’effetto della disacidificazione del vino a seguito della malolattica. Nel grafico 1 sono riportate, con linee tratteggiate, le curve della popolazione dei batteri lattici nelle tesi di Valpolicella inoculate con lo starter dopo la fermentazione alcolica. Al calo di concentrazione dei batteri, osservato nelle tesi inoculate e addizionate di 300 mg/L di lisozima, è seguito però una veloce ripresa della crescita. In termini di cinetica di fermentazione malolattica l’inoculo dello starter non ha prodotto effetti significativi, eccetto che nella tesi trattata con 300 mg/L di enzima nel mosto, dove il consumo di acido malico si è completato con circa 5 giorni di anticipo rispetto alla stessa tesi non inoculata con lo starter (dati non mostrati). Analogamente alla precedente prova anche frazioni di vino Soave, trattate con lisozima, sono state inoculate con lo starter dopo la fermentazione alcolica. In tutte queste tesi la popolazione del ceppo selezionato è andata incontro a una repentina e alta mortalità vanificando di conseguenza l’effetto dell’inoculo stesso. Il contenuto in acido malico, infatti, non è variato rispetto alle stesse tesi non inoculate (dati non mostrati). Uso di starter malolattici Effetto nei rossi e nei bianchi In entrambe le vinificazioni si sono destinate delle frazioni delle tesi per l’inoculo di starter malolattici. In questo modo si è voluto osservare l’eventuale attività residua del lisozima sulla popolazione del ceppo starter inoculato. Questa sperimentazione ha evidenziato il diverso effetto del lisozima, addizionato al mosto o al vino, sull’attività malolattica dei batteri lattici in relazione alla tipologia di vinificazione. I risultati confermano quanto già pre- Vinificazione in bianco 22/2008 • L’Informatore Agrario 57 Degradazione acido malico (g/L) T ENOLOGIA 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 0 5 150 mg/L 300 mg/L 10 15 20 25 Giorni 150 mg/L in coda FA 300 mg/L in coda FA Senza lisozima (tesi di controllo) (*) Addizionate di lisozima all’ammostatura e in coda alla fermentazione alcolica e nella tesi di controllo. GRAFICO 4 - Cinetica di degradazione dell’acido malico nelle tesi di vino Soave (*) L’abbattimento della popolazione indigena è stato di simile entità sia con dosi di 150 sia con 300 mg/L di lisozima. TECNICA mostrato che nel mosto la fi ltrazione e la centrifugazione causano consistenti riduzioni di attività per la rimozione del lisozima combinato con i solidi sospesi (Delfini et al., 2004). Nella vinificazione in bianco l’alta carica dei batteri malolattici indigeni ha rappresentato una condizione ideale per lo scopo prefissato. In questo caso il lisozima si è dimostrato assai più stabile rispetto a quanto osservato nella vinificazione in rosso anche nella dose più bassa; nelle tesi addizionate di enzima nel mosto, anche la dose di 150 mg/L è risultata nociva per lo starter inoculato. Questo risultato è attribuibile, oltre che all’acidità minore del vino Soave rispetto al Valpolicella in questa sperimentazione, anche alla mancanza di interferenze dei polifenoli. Tuttavia con altri parametri enologici l’azione del lisozima nei vini bianchi potrebbe essere differente. Precedenti sperimentazioni hanno dimostrato che la dose di lisozima impiegata è risultata determinante nel controllo della carica batterica indigena in vini bianchi caratterizzati da vari pH (Gerbaux et al., 1997). TABELLA 4 - Analisi dei vini Soave dopo la fermentazione malolattica senza o con l’impiego di lisozima (1) Senza Con lisozima (mg/L) lisomosto vino (2) zima 150 300 150 300 pH 3,75 3,55 3,54 3,57 3,57 Etanolo (% vol.) 12,34 12,32 12,28 12,35 12,40 Zuccheri residui (g/L) 5,08 5,22 4,57 3,81 3,24 Estratto totale (g/L) 24,5 26,2 25,6 24,7 24,6 Acidità totale 4,99 5,95 6,05 5,85 5,95 (g/L) (3) Acido L-lattico (g/L) 1,14 0,04 0,01 0,01 0,04 Acido acetico (g/L) 0,39 0,42 0,38 0,35 0,37 Parametri (1) Alla concentrazione di 150 e 300 mg/L nel mosto e in coda alla fermentazione alcolica. (2) Prima del termine della fermentazione alcolica con residuo zuccherino di circa 15 g/L. (3) In acido tartarico. Le differenze tra le tesi trattate e il testimone sono dovute principalmente all’effetto della disacidificazione del vino a seguito della fermentazione malolattica. dizioni enologiche siano simili a quelle sopra descritte. cedenti studi hanno evidenziato circa la Nella produzione di vini rossi che nediversa persistenza dell’attività del lisozicessitano della completa demalicazione ma nel vino rosso e in quello bianco. l’uso del lisozima potrebbe essere una In particolare Bartowksy et al. (2004) Conclusioni valida soluzione per ottenere fermentadescrivevano un’attività residua del lisozima di circa l’80% in un vino bianco Sulla base delle osservazioni sperimen- zioni «pulite» guidate da starter, quindi Riesling dopo 6 mesi dall’aggiunta di tali, il controllo della microflora lattica di senza interferenze da parte di batteri 150 o 300 mg/L dell’enzima; al contrario, attraverso l’utilizzo di lisozima sembra indigeni. Con ulteriori sperimentazioni si poin vini rossi quali Cabernet Sauvignon e essere facilmente realizzabile nelle vinifiShiraz l’attività del lisozima era nulla già cazioni in bianco; si tratta di individuare tranno definire protocolli più precisi cirdopo due giorni dalla sua aggiunta. la giusta dose da utilizzare in relazione ca le modalità di impiego del lisozima in Più recentemente Tirelli e De Noni all’acidità del vino e allo stato sanitario relazione alla composizione e tipologia (2007) sottolineavano che il lisozima è delle uve al fine di massimizzare il rap- dei vini da trattare. • instabile nei vini rossi giovani nutren- porto costi-benefici. Emanuele Tosi do, di conseguenza, dubbi sulla sua efNel caso della vinificazione in rosso il Michela Azzolini ficacia nel controllare la fermentazione lisozima potrebbe essere utilizzato per Centro per la sperimentazione malolattica. rallentare l’attività malolattica spontain vitivinicoltura - Provincia di Verona In Valpolicella la dose di 300 mg/L nea, ma non per inibirla qualora le conServizio agricoltura, Verona aggiunta all’ammostatuMarta Cristofoletti Nelle vinificazioni in rosso (vino Valpolicella) il lisozima ha ra ha prodotto un ritarGiacomo Zapparoli comportato un limitato abbattimento della microflora batterica do della malolattica sponDipartimento scientifico tanea, e questo può essee tecnologico re sufficiente per favorire Università di Verona fermentazioni malolattiche «pulite» guidate da ceppi Si ringraziano Valerio Udali e Alberto Zardini (Centro starter. per la sperimentazione L’inefficacia del lisoziin vitivinicoltura, Provincia ma, invece, aggiunto nella di Verona, Servizio agricoltura) stessa dose ma in coda alper il lavoro di cantina e l’azienda Lallemand Succursale Italiana la fermentazione alcolica, è per aver gentilmente offerto attribuibile probabilmente il materiale necessario all’alta frazione di lisozima per la sperimentazione. che si lega, e quindi si inattiva, ai componenti solidi Per consultare del vino (vinacce e fecce), la bibliografia: che con la svinatura vengowww.informatoreagrario no allontanati. È stato diit/rdLia/08ia22_3424_web 58 L’Informatore Agrario • 22/2008 T TECNICA ENOLOGIA Articolo pubblicato su L’Informatore Agrario n. 22/2008 a pag. 55 Il lisozima ritarda nei rossi e blocca nei bianchi la malolattica BIBLIOGRAFIA Amati A., Chinnici F., Piva A. (1994) - Il lisozima in enologia per il controllo della fermentazione malolattica. Industrie delle bevande, 23: 215-221. Bartowsky E.J., Costello P.J., Villa A., Henschke P.A. (2004)- Chemical and sensorial effects of lysozyme addition to red and white wines over six months’ cellar storage. Aust. J. Grape Wine Res., 10: 143-150. Delfini C., Cersosimo M., Del Prete V., Strano M., Gaetano G. Pagliata A., Ambrò S. (2004) - Resistance screening essay of wine lactic acid bacteria on lysozyme: efficacy of lysozyme in unclarified grape musts. J. Agric. Food Chem., 52: 1861-1866. Eggert K., Rawel H.W., Nikfardjam M.S.P., Kroll J. (2006) - Interaction between lysozyme and wine components. 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In Valpolicella si è osservato un ritardo di circa 12 giorni del termine della fermentazione malolattica (FML) con dosi di 300 mg/L addizionate al mosto, mentre negli altri casi l’azione dell’enzima si è dimostrata non significativa. Al contrario nel Soave il lisozima ha inibito la FML spontanea indipendentemente dal dosaggio e dal momento di impiego. La persistenza di attività litica dell’enzima in quest’ultimo ha condizionato negativamente l’esito della FML indotta da starter. Al contrario la relativa labilità del lisozima nel vino rosso sembra off rire opportunità di ottenere FML «pulite».