Diapositiva 1 - Università degli Studi di Verona

Genetica 3
Sistemi genetici batterici e virali
• La genetica batterica, coniugazione, trasformazione
• La genetica virale, trasduzione
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Il termine auxotrofia indica l’impossibilità per un organismo di sintetizzare un
particolare composto organico necessario per la propria crescita, che deve
quindi essere assunto necessariamente dall’ambiente in aggiunta ai nutrienti
energetici forniti dall’alimentazione. Molti esseri viventi, incluse piante
eterotrofe ed animali, sono auxotrofi per una o più sostanze, come ad esempio
vitamine ed amminoacidi essenziali. L’auxotrofia è l’opposto della prototrofia
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Griffiths et al., GENETICA 6/E, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright © 2006
Cromosoma e plasmide
A plasmid is a small DNA molecule within a cell that is physically separated from a chromosomal DNA and can replicate
independently. They are most commonly found in bacteria as small, circular, double-stranded DNA molecules. In nature, plasmids
often carry genes that may benefit the survival of the organism, for example antibiotic resistance. While the chromosomes are big and
contain all the essential information for living, plasmids usually are very small and contain only additional information.
Plasmids are considered replicons, a unit of DNA capable of replicating autonomously within a suitable host. However, plasmids, like
viruses, are not classified as life.
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Griffiths et al., GENETICA 6/E, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright © 2006
Evento di ricombinazione
Evento di ricombinazione
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La coniugazione batterica
Trasferimento genico attraverso il contatto fisico tra due batteri, di cui il donatore è
denominato F+ (fertilità positivo) e possiede un pilo di coniugazione, mentre il
ricevente è F-.
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Evento di ricombinazione
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Evento di ricombinazione
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Caratteristiche del fattore F
Tipo
Caratteristiche fattore F
• F+
• F• Hfr
• F’
DNA circolare distinto
assente
integrato nel cromosoma batterico
DNA circolare distinto, porta geni batterici
• F+ x F• Hfr x F• F’ x F-
due cellule F+
una cellula Hfr e una cellula F-
due cellule F’
La trasformazione batterica
Passaggio di frammenti di DNA libero ad un batterio ricevente
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La genetica virale
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• Fagi virulenti: solo ciclo litico
• Fagi temperati: ciclo litico e lisogenico (profagi)
Esperimento di
Lederberg e Zinder
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La trasduzione
Trasferimento del DNA mediato da un virus dei
batteri (virus dei batteri: batteriofago).
• Trasduzione generalizzata: qualunque gene
• Trasduzione specializzata: pochi, specifici, geni
E’ possibile trasferire geni da un batterio a un altro tramite
la trasduzione generalizzata (richiesta degradazione
cromosoma batterico)
Frequenza di trasduzione: da 1/100.000 a 1/1000.000
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Trasduzione
specializzata
(richiesto ciclo lisogenico)
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I virus a RNA
I Virus a RNA sono virus che utilizzano l'RNA
come materiale genetico. Questo acido
nucleico di solito è presente come filamento
singolo, sebbene siano presenti gruppi di
virus che utilizzano un RNA a doppio
filamento.
I principali virus patogeni appartenenti ai
virus
a
RNA
sono
i
virus
dell’immunodeficienza
umana
(HIV),
dell'Influenza e dell'Epatite virale C.
Il virus dell’influenza contiene l’enzima
necessario per la duplicazione del proprio
genoma a RNA. Il filamento di RNA virale
così sintetizzato serve poi sia da mRNA sia
da stampo per la sintesi, mediante
appaiamento complementare delle basi, di
nuove copie del genoma virale. I retrovirus
come HIV presentano invece un ciclo
riproduttivo più complesso
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I RETROVIRUS
Famiglia di virus dotati di membrana
lipoproteica esterna contenenti un genoma
a RNA, che per replicarsi necessitano di un
intermedio a DNA.
Una volta entrato nella cellula ospite il
genoma a RNA del virus va incontro alla
trascrizione inversa nel citoplasma ed il
risultante DNA a doppio filamento (detto
provirus) viene traslocato nel nucleo e
integrato nella cromatina della cellula
ospite.
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Cellula T infettata da HIV
I retrovirus includono tre gruppi
(oncoretrovirus, lentivirus e spumavirus), che
comprendono virus in grado di infettare
diverse specie animali, compreso l’uomo,
determinando infezioni croniche, a volte
associate a trasformazione neoplastica
(oncoretrovirus) o a sindromi lente e
progressive, caratterizzate da
immunodeficienza e disordini neurologici.
Appartengono a questa famiglia, oltre al ben
noto virus dell’immunodeficienza umana (HIV
– “human immunodeficiency virus”), altri virus
oncogeni per l’uomo come HTLV-1 e 2
(“Human T-cell Leukemia Virus” 1 e 2), ed
anche virus della leucemia felina, virus della
leucemia murina (topi) di Moloney (MoLV) e
del tumore mammario murino.
Questa famiglia di virus è stata la prima ad
attirare l'attenzione dei biologi molecolari per
lo sviluppo di vettori per la terapia genica
(vettori retrovirali ).
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I prioni
I PRIONI sono gli agenti infettivi responsabili:
• della Encefalopatia Spongiforme Bovina (BSE) nei bovini
• delle scrapie nelle pecore
• della Malattia di Creutzfeldt-Jakob (CJD) e la sua variante clinica (vCJD)
nell'uomo
• di altre encefalopatie trasmissibili
I Prioni sono proteine normalmente presenti nel cervello e altri tessuti (milza) dei
mammiferi, incluso l'uomo. La loro funzione è quella di favorire la trasmissione
dei messaggi tra le cellule nervose. Si trasformano in proteine nocive o per
mutazione spontanea o per l'arrivo di un prione patologico. Quando il prione nocivo
attacca le cellule cerebrali e trasforma i prioni normali questi, a loro volta, attaccano
e disgregano le altre cellule, dando luogo al tipico aspetto spongioso del cervello da
cui la definizione "encefalopatia spongiforme".
Tutte le malattie animali da prioni note influenzano la struttura del Sistema nervoso
centrale o di altri elementi neurali dei tessuti, e tutti sono attualmente incurabili e
sempre letali. La modalità di infezione del prione è data da una particolare
catena proteica alfa e beta ripiegata in maniera scorretta, che induce altre
proteine ad assumere la stessa conformazione anomala. Queste proteine sono
poi in grado a loro volta di infettare le proteine adiacenti
I prioni
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Caratteristiche del MATERIALE
genetico
•
Deve contenere informazioni complesse
•
Deve replicarsi in modo fedele e deve essere
stabile
•
Deve definire un fenotipo
Il DNA
La scoperta di Griffith del
principio trasformante
impiegando Streptococcus
pneumoniae
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1944: Esperimento di Avery,
MacLeod e McCarty sulla natura
chimica della sostanza
trasformante
S e R: colonie lisce o rugose
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1952: Esperimento di Hershey e
Chase sul virus T2 che dimostra
ulteriormente la natura chimica
del materiale genetico
Nella diapositiva successiva è descritto
l’esperimento di Hershey e Chase per vedere
se, nel corso della riproduzione del fago,
vengono trasmesse le proteine o il DNA.
Il risultato indica che la componente proteica
non entra nella cellula e non viene trasmessa
alla progenie. Di contro, il DNA entra nella
cellula e viene trasmesso alla progenie. Per cui
è il DNA, e non le proteine, il materiale genetico
dei fagi
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Nei virus a RNA, e’ l’RNA
il materiale genetico
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La diffrazione ai raggi X permette di ricavare informazioni
circa la struttura delle molecole
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Il contributo di Rosalind Franklin e Maurice Wilkins
Ma i due litigavano, per cui non sono riusciti a trovare la spiegazione dei dati che
avevano ottenuto. Comunque nel 1962 il nobel è stato dato a Watson, Crick e
Wilkins (Franklin morta nel 1957)
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1953
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I nucleotidi sono formati da zucchero, fosfato e base azotata (purina o pirimidina)
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Watson riconobbe che una adenina poteva legare una timina, e che una
guanina poteva legare una citosina
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Struttura secondaria
del DNA
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Implicazioni della struttura
del DNA a livello genetico:
• Contiene informazioni complesse
• Si replica in modo fedele ed è stabile
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Il dogma centrale della biologia molecolare:
DNA -> RNA -> Proteina
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Cenni sulla struttura dei cromosomi e
sugli elementi trasponibili
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Cromosomi batterici
Generalmente circolari.. Assenza di proteine istoniche, ma presenza
di alcune proteine che comunque favoriscono il compattamento
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Plasmidi
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Cromosomi eucariotici
Lineari. Necessario elevatissimo compattamento, e possibilità di ridurre il
compattamento per replicazione/trascrizione
Cromatina: DNA + proteine (soprattutto istoni)
Due tipi di cromatina:
• Eucromatina: subisce i normali processi di condensazione / decondensazione
nel corso del ciclo cellulare
•
Eterocromatina: permane estremamente condensata (centromeri, telomeri,
cromosoma X inattivo)
Le proteine piu’ abbondanti nella cromatina sono gli istoni: proteine cariche
positivamente (attraggono il DNA che è carico negativamente).
Circa la metà della massa proteica del cromosoma è formata da una serie
eterogenea di proteine non istoniche
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Il centromero
Il centromero è formato da particolari sequenze ripetute molte volte. Nel caso sotto, la
regione ripetuta più volte è di circa 110 basi.
Il centromero è lungo 4000-7000 basi. Nell’uomo il centromero è lungo centinaia di
migliaia di basi.
Regione centromerica di Saccharomices cerevisiae
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I telomeri
I telomeri stabilizzano i cromosomi e ne impediscono la degradazione.
Nella diapositiva è riportata la sequenza nucleotidica dei telomeri eucariotici, che
nell’uomo è ripetuta da 250 a 1500 volte. Questa lunghezza varia da un cromosoma
all’altro e da cellula a cellula
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Dimensioni del genoma di vari organismi
Fago Lambda
Escherichia coli
Saccharomices cerevisiae
50.000
4.500.000
12.000.000
Arabidopsis thaliana
150.000.000
Vitis vinifera
450.000.000
Homo sapiens
3.000.000.000
Mais (Zea Mais)
4.500.000.000
Cipolla (Allium cepa)
Ameba
18.000.000.000
670.000.000.000
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Variabilità nelle sequenze di DNA degli
eucarioti
Nella reazione di rinaturazione il DNA viene tagliato in frammenti lunghi diverse centinaia di basi.
Poi si denatura a 100 gradi e si raffredda lentamente, monitorando l’OD (DNA doppio filamento ha
assorbimento minore a 260nm)
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Curva C0t
Una curva C0t rappresenta la frazione di DNA rimasta a singolo filamento nel corso di una reazione
di denaturazione.
Il livello di rinaturazione dipende da 2 fattori: 1) Concentrazione iniziale di DNA a singolo filamento
(C0). 2) Durata della rinaturazione (t).
Concentrazioni piu’ elevate (o tempi piu’ lunghi) aumentano la probabilità delle collisioni.
Il valore a cui metà del DNA si è riappaiato, è definito C0t ½
Rinaturazione dipende da concentrazione: il primo scalino rappresenta DNA che si rinatura per
valori di C0T molto bassi, pertanto DNA presente in mote copie (ripetuto)
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Tipi di sequenze di DNA
• Sequenze non ripetute (geni)
• Sequenze moderatamente ripetute sequenze di 150300 bp ripetute migliaia di volte :
• Geni per tRNA e rRNA
• SINE (short interspersed elements, senza funzione):
Alu: ripetizioni di 2-300 bp, 106 copie nel genoma umano, 11% del DNA totale).
An Alu sequence is a short stretch of DNA originally characterized by the action of the Alu
restriction endonuclease. Alu sequences of different kinds occur in large numbers in primate
genomes.
• LINE (long interspersed elements): lunghe migliaia
di basi. In maggioranza trasposoni
• Sequenze altamente ripetute (satellite) < 10 bp,
ripetute centinaia di migliaia di volte
Sequenze Alu
Una sequenza Alu è un breve tratto di DNA originariamente caratterizzato come sito di taglio
riconosciuto dall'endonucleasi Alu, un enzima di restrizione. Sequenze Alu di diversi tipi sono
presenti in gran numero nei genomi dei primati. In particolare le sequenze Alu sono gli elementi
mobili più abbondanti nel genoma dell'uomo e per questo possono essere utili per distinguere
DNA umano per esempio da DNA di topo.
Le sequenze Alu misurano in media circa 300 paia di basi e sono quindi classificate come short
interspersed element (SINE). Si stima che le sequenze Alu presenti nel genoma umano siano
più di un milione e che quindi rappresentino il 10.7% del genoma umano totale. Ciò
nonostante meno del 0.5% risultano polimorfiche
Lo studio di questi tratti di DNA è importante per la genetica di popolazione dell'uomo e per
l'evoluzione dei primati, in particolare per l'evoluzione umana. Infatti, le sequenze Alu formano
nei primati un registro fossile relativamente semplice da decifrare in quanto gli eventi di
inserzione delle sequenze Alu sono fedelmente trasmessi di generazione in generazione e sono
facilmente identificabili. Lo studio di queste sequenze può rivelare quindi relazioni di
discendenza in quanto due individui condivideranno una particolare inserzione se hanno un
antenato comune. La maggior parte delle sequenze Alu nel genoma umano possono essere
riscontrate anche nelle corrispondenti posizioni dei genomi di altri primati, tuttavia circa 7.000
inserzioni Alu sono tipiche degli esseri umani
L'inserzione di sequenze Alu è implicata in diverse malattie ereditarie umane e in varie forme di
cancro.
I TRASPOSONI (DNA mobile)
Quando si verifica un evento di trasposizione, un elemento trasponibile, o trasposone, si sposta da
una regione di DNA a un’altra. Barbara Mc-Clintock fu la prima a scoprire i trasposoni negli anni ’40
durante i suoi studi sulla genetica del mais. Da allora, i trasposoni sono stati trovati in tutti i tipi di
organismi, dai batteri all’uomo
La parte principale di una sequenza di inserzione codifica almeno due proteine che catalizzano la
trasposizione. Queste proteine sono note come Trasposasi. Un’altra caratteristica di una
sequenza di inserzione, in comune con molti trasposoni più complessi, si trova appena fuori dal
trasposone stesso. I trasposoni portano infatti su entrambi i lati Ripetizioni fiancheggianti dirette
(3-12 basi) che non fanno parte del trasposone e non si spostano con esso ma vengono generate
dal processo di trasposizione in corrispondenza del sito di inserzione.
Alle estremità di molti – ma non di tutti – trasposoni, sono presenti inoltre le ripetizioni terminali
invertite (9-40 basi) -> forcina
Molti trasposoni contengono geni a parte rispetto a quelli necessari per la trasposizione. Questi
sono, solitamente, i geni che conferiscono resistenza agli antibiotici. Per esempio, Tn3 contiene un
gene che conferisce la resistenza all’ampicillina.
I TRASPOSONI (DNA mobile)
I trasposoni rappresentano fino al 50% del DNA dell’uomo
Alle estremità di molti – ma non di tutti – trasposoni, sono presenti le ripetizioni terminali invertite
(9-40 basi) -> forcina
Su entrambi i lati portano Ripetizioni fiancheggianti dirette (3-12 basi): non fanno parte del
trasposone e non si spostano con esso ma vengono generate dal processo di trasposizione in
corrispondenza del sito di inserzione. Sequenze variabili ma lunghezza costante. Queste ripetizioni
indicano che il TE si inserisce dopo aver effettuato dei tagli a scalino
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Tipi di trasposizione
(movimento di un trasposone da una localizzazione all’altra)
Esistono diversi modelli per spiegare i meccanismi di trasposizione dei trasposoni.
• Trasposizione replicativa (duplicazione)
• Trasposizione non replicativa (spostamento)
Nel modello replicativo avviene la trasposizione da un cromosoma a un altro o tra
due siti lontani di uno stesso cromosoma. Secondo tale modello, la porzione di
cromosoma che contiene il trasposone si fonde per breve tempo con la porzione di
cromosoma accettrice. A questo punto, il trasposone si duplica, e una delle copie si
posiziona nel DNA del cromosoma accettore, mentre l'altra rimane nella porzione
donatrice. Questo tipo di trasposizione viene perciò anche chiamata trasposizione
replicativa.
Nel modello non replicativo (o anche conservativo), il trasposone, in genere
composito, si sposta da una posizione all'altra del cromosoma, senza che questo si
replichi. Ciò permette lo spostamento fisico del trasposone, dalla posizione iniziale a
quella finale. La trasposizione conservativa prevede un taglio netto delle estremità
del trasposone e un taglio netto nel DNA ricevente. Il trasposone viene così integrato
senza formare ripetizioni fiancheggianti dirette.
I trasposoni nei batteri
Le sequenze di inserzione batteriche contengono solo gli elementi necessari per la
trasposizione. Il primo di questi elementi è un gruppo di sequenze particolari localizzate
all’estremità del trasposone, una delle quali è la ripetizione invertita dell’altra. Il secondo elemento
è un gruppo di geni che codificano gli enzimi che catalizzano la trasposizione.
La trasposizione avviene con un meccanismo di ricombinazione del DNA del trasposone con
quello del sito in cui esso traspone, che viene detto di 'ricombinazione sito-specifica'. Il
trasposone si può inserire soltanto in regioni di DNA in cui si trovano brevi sequenze
nucleotidiche che fanno da bersaglio per l'inserzione ('siti di inserzione'). La sequenza
nucleotidica di tali siti sembra irrilevante e non omologa (cioè non somigliante) ad alcuna
specifica sequenza del trasposone. Non occorre quindi affinità tra sequenze del trasposone e sito
di inserzione, come invece nella ricombinazione omologa, che avviene tra geni aventi le stesse
sequenze nucleotidiche.
I trasposoni batterici appartengono a due classi: trasposoni semplici (detti anche di
'classe I') e trasposoni compositi (di 'classe II').
Trasposoni batterici semplici (classe I)
(sequenze di inserzione)
TE (Transposable Element) semplice, costituito da trasposasi e da due
sequenze (10-40 bp) simili tra di loro disposte in senso inverso alle due
estremita’ (sequenze di inserzione; IS). Lungo generalmente da 800 a 2000 bp.
Ha una trasposizione replicativa.
Possiede in pratica solo ripetizioni fiancheggianti, le ripetizioni terminali invertite
e il gene per la trasposasi, ma può contenere anche geni importanti, ad es. di
resistenza alla penicillina
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Trasposoni batterici compositi (classe II)
Sono costituiti da due IS nella stessa direzione o in direzione opposta, che si trovano
vicine o traspongono come una sola unita’, trasportando con se’ la parte di DNA
compresa tra loro. Fra le due IS si trovano il gene per la trasposasi e frequentemente
almeno un gene per la resistenza a un antibiotico. Il Tn3, che è il più studiato fra i
trasposoni di classe II, codifica anche per una proteina regolatrice, la quale, mediante
repressione, controlla la sintesi della trasposasi, evitandone in tal modo una
produzione eccessiva, che non sarebbe utile per un evento quale la trasposizione che
avviene con bassa frequenza. Presentano trasposizione conservativa (taglia-incolla
senza replicazione)
Segmento di DNA che puo’ portare info aggiuntive – es resistenza antibiotici - fiancheggiato da 2
copie di una sequenza di inserzione. Sono indicati con la sigla Tn seguita da un numero
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Mu: un batteriofago trasponibile
Alcuni batteriofagi si riproducono per trasposizione. Sebbene non abbia ripetizioni terminali
invertite, quando si inserisce nel cromosoma Mu genera brevi ripetizioni fiancheggianti (5 bp).
Trasponendo, Mu provoca mutazioni nel sito di inserzione, proprietà caratteristica degli
elementi trasponibili
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I trasposoni negli eucarioti
I trasposoni degli eucarioti sono molto simili, per struttura, a quelli procarioti. Possiedono geni
che codificano per le proteine necessarie per la trasposizione e che permettono loro di excidersi
e reintegrarsi in vari luoghi del genoma. Oltre ai geni coinvolti nei processi di trasposizione,
la maggior parte di essi possiede anche numerosi altri geni, la cui funzione, però, è in larga
parte ancora ignota. Come i trasposoni procariotici, possono essere la causa di mutazioni
genetiche, inserendosi all'interno di geni funzionali e alterandone, o impedendone, le normali
funzioni.
Sono stati scoperti trasposoni praticamente in tutti gli organismi eucarioti, ma i più studiati sono
quelli delle piante (particolarmente del mais), del moscerino della frutta e dell'uomo.
I trasposoni negli eucarioti appartengono a due classi:
• trasposoni compositi (di 'classe II')
• retrotrasposoni.
I Retrotrasposoni si spostano mediante un intermedio a RNA: il retrotrasposone, costituito
comunque da un filamento di DNA inserito in un cromosoma, si replica in un filamento di RNA
(mediante trascrizione) e, questo filamento, viene poi copiato a sua volta in uno a DNA, capace
di integrarsi in una nuova posizione del genoma.
Studi hanno dimostrato che, almeno alcune particolari famiglie di brevi e lunghe sequenze
ripetute del genoma umano, mostrano proprietà di trasposizione, in particolare la famiglia
denominata Alu
Il trasposone Ty del lievito
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Il sistema Ac-Ds nelle piante
Ac: Activator
Ds: Dissociation
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Retrotrasposoni
I trasposoni che traspongono per
mezzo di un intermedio a RNA
sono definiti retrotrasposoni
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I trasposoni causano mutazioni
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La trasposizione
causa anche
riarrangiamenti
cromosomici
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La Neurofibromatosi di tipo 1 (NF1) o malattia di von Recklinghausen fa parte di
un gruppo di malattie genetiche multisistemiche e progressive dette Facomatosi
o anche sindromi “neurocutanee”: tumori a carico della pelle e dei nervi.
La NF1 ha un'incidenza di 1 su 2500–3000 nati ed una prevalenza di circa 1 su
4000–5000 individui nella popolazione generale. Si trasmette con modalita’
autosomica dominante, il 50% dei casi sono sporadici.
Il gene NF1 è stato localizzato in sede pericentrometrica del braccio lungo del
cromosoma 17. E’ un gene oncosoppressore di oltre 335 kb di DNA genomico,
con almeno 60 esoni, che codifica per una proteina di 2818 aa chiamata
neurofibromina che si localizza nei microtubuli citoplasmatici e che svolge una
regolazione negativa della crescita cellulare con attività di controllo di attivazione
sul ras pathway. Da qui la funzione di soppressore di
tumore svolto dalla neurofibromina.
Nel 1991 è stato scoperto, in un uomo di 31 anni affetto da
neurofibromatosi, che il danno genetico era stato causato da una
trasposizione della sequenza Alu in uno degl introni di NF1: errore nello
splicing con errata rimozione di un esone.
I genitori erano entrambi privi della sequenza Alu in quell’introne