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Viticoltura ed enologia
Serena Fontanot,
Maria Ester Ninino,
ERSA
Centro Pilota per la Vitivinicoltura
NON TUTTO IL MALO-LATTICO
VIEN PER NUOCERE
LA SFUGGENTE ALCHIMIA
DEI BATTERI FERMENTATIVI
L
'
attuale tendenza del mercato vitivinicolo si
configura nella richiesta di prodotti dotati di pregio organolettico e peculiarità tali da renderli
originali ed unici.
In risposta le Aziende propongono vini di qualità, ottenuti dalla combinazione di diversi aspetti: lavorazioni attente e mirate in vigneto, tecnologie in cantina innovative che esaltino il prodotto ed infine, ma non meno importante, l'applicazione di biotecnologie avanzate quali l'utilizzo appropriato di ceppi selezionati di
Saccharomyces cerevisiae e Batteri Malolattici.
Questo articolo vuole fissare l'attenzione proprio sulla funzione fondamentale di questi ultimi, visti come una variabile dipendente dalle
condizioni iniziali di vinificazione per ottenere
un prodotto tipico ed esclusivo.
1
COS'È LA
FERMENTAZIONE
MALO-LATTICA
La fermentazione malo-lattica (=FML) costituisce una tappa importante per ottenere un
vino organoletticamente evoluto; ancor oggi, tuttavia, risulta difficile monitorare i fenomeni che in essa si svolgono.
La FLM viene definita anche seconda fermentazione: il termine "seconda" perché segue la fermentazione alcolica ed il termine
"fermentazione" perchè corrisponde ad uno
sviluppo di anidride carbonica ad opera dei
Batteri Malolattici (=BML).
Il termine in realtà non è appropriato, in
quanto si tratta di una decarbossilazione diretta dell'acido malico che origina l'acido
lattico per mezzo dell'attività di un unico
enzima.
Spesso, negli anni passati, il processo avveniva in modo spontaneo e, anche per questo, incontrollato; infatti, durante questa fermentazione, il processo principale ed evidente risulta la disacidificazione biologica
del vino, contribuendo ad un miglioramento
dello stesso. Il guadagno in qualità è dovuto
a due fattori: una diminuzione della acidità
fissa con conseguente aumento del pH e la
maggior morbidezza dell'acido lattico che
sostituisce l'asprezza dell'acido malico.
2 Tipico aspetto di una colonia di Oenococcus
oeni. I batteri malolattici (BML) sono microrganismi
unicellulari procarioti, al microscopio ottico
presentano diverse forme (cocchi e bastoncelli), si
dividono per scissione; presentano caratteristica
Gram +, Catalasi - (con alcune eccezioni), non sono
mobili ed hanno esigenze nutritive complesse.
Notiziario ERSA 3/2005
Tab. 1 - Classificazione dei BATTERI
La FML conferisce inoltre al vino una stabilità microbiologica, per eliminazione di
substrati fermentescibili ancora presenti nel
mezzo.
Nella fermentazione alcolica (=FA) si verifica una riduzione qualitativa e quantitativa
dei batteri lattici dovuta alla competizione
tra microrganismi, alla produzione di etanolo, di anidride solforosa e di sostanze antagoniste (variabili a seconda del ceppo di
Sacchar omyces cer evisiae utilizzato).
Questa selezione naturale fa predominare
l'emergente genere Oenococcus il più resistente fra tutti gli altri (fig. 2, tab. 1).
Come controparte, la FML sviluppa composti aromatici quali acetoino, diacetile, 2,3butandiolo ed acido acetico che, se presenti in concentrazioni minime, contribuiscono
alla complessità del vino, ma in dosi elevate compromettono fatalmente il risultato finale. Nel vino, infatti, spesso non esistono
condizioni idonee, compatibili alla crescita
dei BML e quindi la loro moltiplicazione ha
esito finale imprevedibile, accompagnato
ad esempio alla presenza di composti indesiderati e tossici per il consumatore come le
amine biogene ed il carbammato di etile (o
uretano).
Da tutto ciò si deduce l'essenzialità di uno
studio accurato sul controllo delle FML
spontanee non solo per esigenze biotecnologiche e di mercato ma per curare ed
approfondire l'imprescindibile aspetto sanitario.
Tab. 2 - La principale reazione nella FML
Acido L malico
E1
Acido L lattico + CO2
[E1 = enzima malolattico]
Questa reazione è diretta, con produzione di CO2 ed utilizzazione di un unico enzima; intervengono pure NAD+
e lo ione Mn2+ indispensabili alla reazione ma non coinvolti in modo convenzionale. Un'ipotesi probabile del
meccanismo sostiene che la reazione avvenga in due
steps:
L malato
decarbossilazione
ossidativa
• ETERO-FERMENTATIVI: dal metabolismo del glucosio si ottiene acido lattico,
etanolo, anidride carbonica ed acido acetico; sono rappresentati dal genere
Oenococcus e Leuconostoc (cocchi)
• OMO-FERMENTATIVI: dal metabolismo del glucosio si ottiene solo acido lattico (DL o L); sono rappresentati dal genere Pediococcus (cocco)
• OMO ED ETERO-FERMENTATIVI: dal metabolismo del glucosio si possono seguire entrambe le vie precedentemente indicate; sono rappresentati dal genere Lactobacillus (bacillo) e nell'ambito di questo gruppo si distinguono
1 OMO-FERMENTATIVI STRETTI: non presenti nel vino
2 ETERO-FERMENTATIVI FACOLTATIVI: dal metabolismo di una molecola di
glucosio si ottengono due molecole di acido lattico; dai pentosi si ottiene acido
lattico ed acido acetico
3 ETERO-FERMENTATIVI STRETTI: dal metabolismo del glucosio si ottiene
acido lattico, etanolo, anidride carbonica ed acido acetico; dai pentosi acido
lattico ed acido acetico.
I pericoli in questione possono essere così riassunti:
1. Acidità volatile con valori superiori alla norma; alla quota normalmente apportata dai lieviti si somma un'aliquota significativa
dovuta ai BML. Le specie maggiormente incriminate sono alcuni
ceppi di Oenococcus oeni, Lactobacillus brevis, L. gardii e L.
kunkeei.
2. Eccesso di diacetile (tab. 4, fig. 5)
3. Aromi e gusti indesiderati
4. Scomparsa del fruttato
5. Scomparsa del colore
6. Produzione di amine biogene
7. Produzione di aroma di foglia di geranio in seguito all'utilizzo di
acido sorbico come coadiuvante enologico
[Per i punti 3, 4, 5 e 6 vedi il paragrafo "Importanti reazioni secondarie legate alla FML"]
L'enzima funziona solo in presenza del fattore NAD+ e ioni bivalenti Mn2+ che si fissano prima sulla proteina E1 e poi sull'acido L-malico. Il pH ottimale per l'enzima è 5,9
ed è per questo che l'attività di E1 si mantiene solo all'interno della cellula, in un ambiente protetto dalla permeabilità selettiva della membrana nei confronti di etanolo,
acidi e polifenoli.
piruvato-E1
E1=enzima malolattico
NADH + H+
piruvato-E1
NAD+
L- lattato + E1
Per decarbossilazione aumenta il pH intracellulare con
l'entrata di acido malico e l'uscita di acido lattico; si
crea una forza protonica di energia conservata sottoforma di ATP mediante l'azione dell'ATP-asi di membrana
(vedi figura a lato).
3
POMPA_ATP
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Viticoltura ed enologia
FATTORI CHE
CONDIZIONANO LA
FERMENTAZIONE
MALO-LATTICA
Come già ricordato i BML trovano un ambiente sfavorevole a causa di numerosi ostacoli: alcuni sono facilmente gestibili (SO2 e temperatura), altri sono insormontabili perché non
modificabili (etanolo e pH).
In sintesi, i fattori condizionanti l'avvio della fermentazione malo lattica sono:
Anidride solforosa
Se la concentrazione di
anidride solforosa libera
è inferiore a 5 ppm ci può
essere uno sviluppo ottimale batterico, mentre
valori di 12 ppm costituiscono condizioni difficili e
limite per la sopravvivenza; esiste infatti un effetto
inibitorio a carico delle
ATP-asi di membrana
(fig. 3), con una conseguente perdita della semi-permeabilità della
membrana cellulare.
Valori di anidride solforo-
sa totale inferiori a 30
ppm favoriscono la fermentazione malo lattica,
tenori superiori a 50 ppm
la rendono difficile.
METABOLISMO
DEI BML
L'innesco del metabolismo dei batteri nella
FML è articolato in tre fasi:
Temperatura
Le condizioni favorevoli si
possono avere a temperature superiori a 18 °C
(senza sbalzi termici),
mentre risulta più difficile
un mantenimento ed uno
sviluppo di BML a temperature inferiori a 15 °C.
Un raffreddamento per
ottenere un avvio di fer-
mentazione malolattica
risulta un fattore di rallentamento del processo
mentre un aumento della
temperatura può stimolare l'inoculo dei batteri
malo-lattici.
Etanolo
La resistenza all'etanolo
da parte dei BML va da
un valore di 10 fino al
12-15% (v/v).
Il meccanismo d'azione
dell'etanolo è di incrementare la fluidità della
membrana ed in contem-
Crescita cellulare
I batteri utilizzano gli zuccheri per ottenere
energia; non c'è degradazione di acido malico né di acido citrico ma si osserva un leggero incremento di acido acetico.
Fase stazionaria I
I batteri non utilizzano più gli zuccheri; è il
momento in cui trasformano l'acido malico
in lattico senza degradare l'acido citrico né
produrre acido acetico.
Come è già stato accennato, il processo consiste in una decarbossilazione diretta dell'acido malico, da cui si origina acido lattico per
mezzo dell'attività di un unico enzima, secondo lo schema:
Acido L malico
enzima
malolattico
Acido L lattico + CO2
Questa reazione è diretta, con produzione di CO2 ed utilizzazione di
un unico enzima; intervengono pure NAD+ e lo ione Mn2+ indispensabili alla reazione ma non coinvolti in modo convenzionale (tab. 2).
La degradazione totale dell'acido malico in lattico e lo sviluppo di
CO2 induce un cambiamento importante per il vino: l'abbassamento
per via microbiologica della acidità fissa, con conseguente aumento
del pH; l'aspro dell'acido malico viene sostituito dalla morbidezza
del lattico. Proprio questa è la motivazione che spinge ad utilizzare
poranea, scompigliandone la disposizione a struttura ordinata, por ta a
morte la cellula stessa
che non rappresenta più
un'unità funzionante.
pH
Nell'intervallo tra 3,3-3,5
risultano favoriti i BML,
mentre è più difficile il loro
sviluppo a valori inferiori a
3,2.
Il pH è uno dei fattori più
importanti: più alto risulta,
più il mezzo diviene ospitale per la cellula batterica.
Tanto più alto risulterà il
pH, tanto più saranno numerose le specie di microrganismi che vi possono crescere; la selezione della
specie Oenococcus oeni è
infatti legata al pH. Nei vini
con pH elevato è la specie
preponderante, ma non l'unica, che trasforma l'acido
malico in acido lattico. Nei
casi in cui la selezione dovuta al pH è meno spinta,
Lactobacilli e Pediococchi
crescono facilmente comportandone lo scadere della
qualità finale.
Fase stazionaria II
I batteri non degradano gli zuccheri; non c'è
catabolismo del malato; è il momento in cui
consumano l'acido citrico producendo acido
acetico e diacetile in eccesso. Questa è la fase da evitare in vinificazione mediante trattamenti quali SO2 e lisozima. E' in questa fase
che si producono aumenti di acidità volatile
e la produzione di aromi violenti. In qualsiasi momento - ma in particolare durante e dopo questa fase - se il vino viene lasciato senza controlli, può divenire sede di crescita di microrganismi di alterazione (Brettanomyces,
Lactobacillus e Pediococcus), capaci di produrre odori molto sgradevoli ed amine biogene.
la FML non solo per i vini rossi ma anche per quelli bianchi (vedi
Chardonnay ed in particolare Sauvignon, che così acquista in intensità e complessità).
La reazione malolattica è indipendente dalla crescita: una cellula
batterica di Oenococcus oeni - anche se si trova in un mezzo non
adeguato - continua la trasformazione dell'acido malico.
Già una concentrazione di 5x106 - 107 ufc/ml di Oenococcus oeni
permette la degradazione dell'acido malico se le cellule sono attive e
vigorose. L'unica condizione per l'attività è che la cellula conservi intatta la membrana cellulare, che isola il sistema enzimatico dall'ambiente, per mantenere il pH interno al valore ottimale ed assicurare
la presenza di coenzimi e cofattori.
Essendo l'integrità di membrana strettamente correlata alla vitalità
cellulare si può affermare che solo una cellula vitale è attiva.
Notiziario ERSA 3/2005
Tab. 3 - BML selezionati
FERMENTAZIONE
MALO-LATTICA
INDOTTA
RAPPORTO
LIEVITOBATTERE ML
La FML indotta rappresenta una situazione
guidata dai BML introdotti ed inoculati in diversi momenti della vinificazione.
Così come sono riconosciuti i vantaggi derivati dall'utilizzo di ceppi specifici di lieviti
selezionati per tipicizzare il prodotto enologico, altrettanto si può dire di come risulti
fondamentale la scelta dei ceppi selezionati
di BML (tab. 3).
Fondamentale risulta l'ottimizzazione nella
scelta dell'adeguato binomio Lievito-Battere
Malolattico.
Il motivo che spinge a indurre la FML con
BML selezionati-starter, essendo già chiaro e
testato il loro metabolismo, è la certezza di
ridurre se non eliminare molti degli inconvenienti sopra menzionati, che così non rappresentano più dei reali pericoli. La FML indotta costituisce in tal modo una risposta
adeguata alla soluzione degli enigmi e degli
eventuali problemi che potevano crearsi in
una FML spontanea e alla sua gestione da
parte degli enologi.
Come si può evincere dalla tabella 1 molti
sono i BML riconosciuti dalla microbiologia.
Nella realtà vino solo alcuni ceppi di
Oenococcus oeni hanno una funzione migliorativa con il maggiore rapporto beneficio/rischio.
L'inoculo dei BML selezionati avviene nel sistema mosto-vino anche se le condizioni
ambientali, come già descritto, non favoriscono il loro sviluppo.
I lieviti Saccaronyces cerevisiae producono
etanolo, anidride solforosa ed altri fattori antagonisti, determinando una competizione nei
confronti dei nutrienti ed influendo pertanto
negativamente sulla crescita dei BML e sul loro
metabolismo.
Gli stessi lieviti, tuttavia, possono favorire la
FML poiché possono bloccare i composti inibitori per i BML quali pesticidi e acidi grassi e
fornire substrati derivati dalla loro autolisi.
4 Sviluppo dei
microrganismi durante
la fermentazione
alcolica e la
fermentazione
malolattica
Sono ceppi nell'ambito del genere Oenococcus che presentano alcuni vantaggi permettendo di ottenere una
FML priva di rischi quali arresti di fermentazione, produzioni anomale di sostanze tossiche o di off-odor.
I ceppi vengono selezionati considerando le caratteristiche tecnologiche e metaboliche:
• isolamento con terreni specifici
• sviluppo a concentrazioni crescenti di etanolo da 10
a 16% volume/volume
• sviluppo a temperature crescenti da 15 a 18 °C
• sviluppo a concentrazioni crescenti di SO2 molecolare
da 0,2 a 0,6 mg/l
• sviluppo a valori crescenti del pH tra 3,1 e 3,5
• prove di capacità di degradazione dell'acido malico
• prove biochimiche con diversi zuccheri (glucosio,
fruttosio, miscele dei due, etc.)
Nella selezione di un ceppo di BML i criteri
sono numerosi e mirati al miglioramento del
prodotto: non solo vengono eliminati i ceppi che possiedono proprietà metaboliche
negative tali da generare un profilo aromatico scadente, ma vengono evidenziati quelli
che incidono favorevolmente sulle caratteristiche sensoriali finali.
Ecco quindi che una FML può portare a molteplici aspetti positivi:
•
•
•
•
•
•
•
diminuzione della acidità totale
Incremento delle complessità aromatiche
diminuzione dell'astringenza
rotondità in bocca
riduzione delle note vegetali
diminuzione dei gusti amari
presenza di diacetile
Come si evince dalla figura 4, la FA e la FML
sono successive una all'altra; possono concludersi più o meno rapidamente con maggiore o
minore successo in proporzione al binomio
lievito-battere e la presenza o l'assenza di SO2
di origine esogena (con aggiunta di bisolfito)
od endogena (prodotta da Saccaronyces cerevisiae). Quando la SO2 libera è inferiore a 20
mg/l o la SO2 totale inferiore a 60 mg/l, i batteri recuperano la loro completa vitalità.
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Viticoltura ed enologia
Quando i BML vengono inoculati insieme ai lieviti la vitalità dei primi diminuisce e viene
recuperata solo alla fine della FA, che però non ne viene affatto influenzata.
Durante l'isolamento, la crescita e la liofilizzazione, i BML perdono alcune caratteristiche di
resistenza ed è per questo motivo che i BML usati oggi giorno sono ad inoculo diretto.
I ceppi vengono sottoposti così ad acclimatamento e possono venir utilizzati sia su vino in
condizioni favorevoli (direttamente) che in situazioni difficili ed ostili (mediante passaggio
in "pied de cuve" con l'aggiunta di un nutriente specifico).
QUANDO E COME
ESEGUIRE
L'INOCULO?
IMPORTANTI
REAZIONI
SECONDARIE
LEGATE ALLA
FML
Decidere quando inoculare una coltura di BML selezionati non è un'opzione facile.
Diverse sono le considerazioni del mondo scientifico a questo riguardo anche se nella
pratica si possono brevemente riassumere:
1. coinoculo: si tratta di un'aggiunta contemporanea di lieviti e BML;
2. un terzo della FA: in questa situazione gli zuccheri riducenti sono di circa 30 g/l;
3. fine FA: in questa situazione gli zuccheri riducenti sono di circa 100 mg/l fino ad un
massimo di 1 g/l.
Dalla ditta Lallemand è stata approntata una prova nella quale vengono confrontate le tesi sopra citate di FML indotte in confronto ad un testimone (FML spontanea) partendo da
una massa unica. I risultati sono sorprendenti sotto alcuni aspetti:
• i prodotti finali possedevano caratteri sensoriali talmente diversi da identificare quattro
tipologie finali di vino;
• l'acido malico nel caso del coinoculo veniva rapidamente e completamente trasformato in acido lattico;
• sia nei vini bianchi che nei vini rossi il profilo sensoriale ottenuto per coinoculo risulta
quello di un vino bilanciato (con corpo morbido e armonico, note burrate e fruttate) al
contrario di un vino senza FML, dove prevale il carattere acido dell'acido malico e che
possedendo una disarmonia degli aromi post-fermentativi porta ad uno squilibrio fra i
diversi sentori.
Alcuni autori (Delaquis P. et al.) rafforzano l'idea che risulti fondamentale una scelta ottimale ed oculata delle associazioni Lievito-BML; prevedendo e conoscendo a priori le
condizioni operative e/o i fattori che potrebbero intervenire positivamente o negativamente su questa sinergia.
Altri autori (Cavazza A. et al.) sostengono sia preferibile inoculare i BML dopo i 4 giorni
dall'avvio della FA previo un protocollo di riattivazione ed ambientamento in mosto.
I sistemi di inoculo più diffusi sono:
1. inoculo del vino che subirà la FML con un altro in cui è già avvenuta o è in corso; è il
sistema più diffuso e con maggior garanzie di successo.
2. inoculo diretto con BML selezionati, accorciando la lunga fase di latenza di Oenococcus
oeni; il consumo di acido malico è molto veloce per gli starter immessi dopo 4 giorni
dalla FA; molto lento e stentato quello dopo la fine della FA.
L'acido citrico - che deriva da quello naturalmente presente nell'uva - nel vino fa registrare dosaggi compresi tra 0,1-0,7 g/l; molti ceppi di BML sono in grado di metabolizzarlo durante la FML.
Il metabolismo dell'acido citrico è generalmente seguente a quello dell'acido malico:
infatti esso ha inizio quando circa il 25%
dell'acido malico è stato degradato. Dal
metabolismo dell'acido citrico si formano
molti composti aromatici quali il diacetile,
acetoino e 2,3-butandiolo (fig. 5).
Nei lieviti si può notare una produzione
modesta di diacetile, acetoino e 2,3-butandiolo mentre nei BML la produzione risulta tre volte superiore.
Se il diacetile è presente in basse concentrazioni (1-4 mg/l) si hanno nel vino note
"burrate" e di "caramelle butterscotch";
se presente ad elevate concentrazioni (2-7
mg/l a seconda del vino), maschera le caratteristiche varietali e conferisce una nota
di burro o di formaggio che rende l'aroma
pesante e sgradevole.
Notiziario ERSA 3/2005
Una maggior concentrazione del diacetile è generalmente correlata con l'elevata quantità di
acido citrico del vino, anche se la relazione è in
funzione di altri fattori (tab. 4). Le altre reazioni coinvolgono diversi metabolismi, ma riguardano solo alcune specie di batteri.
Ceppi di Pediococcus damnosus, di
Lactobacillus hilgardii e di Oenococcus oeni
possono produrre piccole quantità di amine
biogene quali l'istamina, la putrescina e la cadaverina (derivanti rispettivamente dall'istidina,
arginina e lisina per decarbossilazione) ed inoltre, ad un pH superiore a quello del vino, una
perdita di fruttato ed astringenza. La concentrazione di queste sostanze azotate è altamente
variabile in funzione del ceppo e, pur non
avendo la completa certezza, possono causare
effetti nocivi alla salute.
Altre reazioni interessano il gruppo carbonile,
che per acetilazione di lisina ed ornitina, origina composti eterociclici aromatici: le tetra-idropiridine, che danno al vino un "sapore di topo"
o di "riso basmati in acqua".
Per carbossilazione e riduzione dell'acido cinammico vengono invece sintetizzati i fenoli
volatili che possono essere suddivisi in due
gruppi; ogni rappresentante determina caratteristiche organolettiche diverse che sono responsabili di note aromatiche originali come
indicato nel seguente schema.
Gruppo
Sostanza
Impatto
sensoriale
Etil-fenoli
4-etil-fenolo
4-etil-guaiacolo
Vinil-fenoli
4-vinil-fenolo
4-vinil-guaiacolo
Cavallo
Affumicato,
speziato
Colla
Pepe,
Garofano
Sia le tetra-idro-piridine che i fenoli volatili
vengono prodotti da ceppi di Lactobacillus
eterofermentante, Oenococcus oeni e anche
da lieviti come Dekkera/Brettanomyces.
IN CONCLUSIONE
FATTORI
CONSEGUENZE
Ossigenazione durante la fermentazione alcolica del mosto
Ossidazione dell'alfa-acetolattato a
diacetile
Produzione ed utilizzazione del diacetile da parte di S.c. attivi dopo la
fermentazione alcolica
Sintesi ed utilizzazione di diacetile in
base al ceppo di BML
I BML lattici quando sono in numero
ridotto non riescono ad utilizzare il
Diacetile che hanno prodotto
Temperatura durante la fermentazione malo lattica
A 18 °C si determina una alta produzione di diacetileA 25-30 °C si determina una bassa produzione di diacetile
Presenza di zuccheri residui durante
la fermentazione malo lattica
Basse concentrazioni di zuccheri che
non vengono utilizzate a scopo energetico nei BML lattici nella via dell'acido citrico, determinano basse produzioni di Diacetile (vedi Fase stazionaria II)
Tab. 4 - Fattori che influenzano la concentrazione finale di diacetile
S.c. = Saccharomyces cerevisiae
5
Metabolismo dell'acido citrico
I BML oggi in commercio sono sempre più
efficaci ed efficienti, poiché l'industria ha
migliorato la capacità di isolare, moltiplicare
e confezionare i medesimi sotto forma di
preparato commercioale.
L'aggiunta di BML nel mosto e/o nel vino richiede una accuratezza e sensibilità da par-
te dell'enologo che dovrà essere in grado di
gestire con rigore e cura l'igiene, la tecnica
di vinificazione ed il controllo analitico.
I BML infatti sono microrganismi molto più
sensibili dei lieviti agli stress ambientali; l'enologo deve quindi porre un occhio di riguardo anche al metabolismo dei batteri, vi-
26
Viticoltura ed enologia
sto che oramai è stato acclarato che non si
deve eccedere nell'uso della anidride solforosa, soprattutto se il pH del vino risulta
particolarmente basso.
Il Laboratorio di Microbiologia enologica
dell'ERSA di Gorizia sta rifinendo l'impostazio-
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