Ingegneria genetica Agrobacterium (Poma)

Agrobacterium tumefaciens
batterio aerobio Gram negativo
induce tumori nella zona d'infezione (GALLA DEL COLLETTO)
le cellule infette acquisiscono la proprietà di crescere in modo non regolato
la mantengono anche se il batterio non è più presente
Questo sovverte il metabolismo della cellula mettendola al
servizio del suo sofisticato parassita genetico
Gli ormoni vegetali indotti sono la causa della crescita non regolata
Le cellule danneggiate di una pianta
(per es. da una lesione)
liberano fattori che attivano nel batterio i geni vir, della virulenza,
localizzati nel PLASMIDE TI, tumor inducing
I plasmidi sono molecole di DNA circolare extracromosomico
non strettamente necessari ai batteri, ma che apportano vantaggi
resistenza ad antibiotici,
patogenicità,
capacità di metabolizzare in nutrienti sostanze insolite
La sintesi di OPINE avviene grazie ad alcuni enzimi codificati dal T-DNA i quali
portano alla modificazione di certi aminoacidi che solo il batterio infettante è in
grado di metabolizzare come fonte di carbonio e di azoto
Processo di infezione
1. Chemotassi e legame iniziale del batterio al sito della lesione;
2. Sviluppo di un ancoraggio solido;
3. Inizio della escissione del T-DNA e
del suo impacchettamento con proteine;
4. Costruzione del canale transmenbrana;
5. Migrazione del T-DNA nella cellula vegetale;
6. Migrazione del T-DNA nel nucleo, integrazione e trascrizione.
Produzione dei fattori di trascrizione della virulenza
Escissione del T-DNA all'altezza delle due SEQUENZE BORDER
a monte ed a valle del T-DNA stesso
Trasferimento come singolo filamento nella cellula vegetale
(processo simile alla coniugazione batterica)
Riparazione del plasmide per replicazione del DNA
Una volta all'interno della cellula, al T-DNA non rimane che entrare nel
nucleo ed integrarsi col DNA cellulare in un sito casuale, in copie multiple
Geni vir:
Copiano il DNA
Attaccano un prodotto al T-DNA copiato che agisca come guida
Aggiungono proteine per un’azione protettiva
Aprono un canale nella membrana cellulare batterica
Agrobatterio non-disarmato
Qualsiasi ceppo selvatico, cioè con un plasmide Ti non modificato
Agrobatterio disarmato
Ceppo incapace di indurre tumori, perché privato dei geni per la
produzione di ormoni
Vettori di trasformazione
Devono avere almeno uno, ma solitamente entrambi, i “borders”
Devono avere un “selectable marker” per la selezione delle piante
trasformate
Devono avere un “selectable marker” per l’introduzione del vetore in
agrobacterio
Caratteristiche di un plasmide Ti
Le regioni del T-DNA codificanti ormoni ed opine possono
essere rimosse senza influenzare il processo di
trasformazione
Le uniche sequenze indispensabile al trasferimento
del T-DNA sono i due “borders”, LB e RB
Cointegrativi (si integrano in un plasmide Ti residente)
Deve esserci una regione di omologia tra il vettore ed il plasmide Ti
Binari (capaci di replicazione autonoma)
Sono in grado di replicarsi in E.coli e in agrobacterium
Fasi principali della trasformazione mediante agrobatterio
Preparazione del
ceppo di agrobatterio
Co-coltura di espianti
fogliari ed agrobatterio
Selezione e rigenerazione
dei trasformanti
Considerazioni utili
Il sito di integrazione del T-DNA è casuale
Uno, due o più T-DNA si possono integrare nel genoma di una
singola cellula vegetale
Quando ciò accade, le diverse copie di T-DNA si possono
ritrovare:
-in un unico locus
-In loci differenti, sullo stesso o su un altro cromosoma
Considerazioni utili
Se più copie del T-DNA sono in un locus, esse possono trovarsi
orientate nello stesso verso oppure opposte
L’integrazione procura al genoma vegetale piccole delezioni (13-73 bp)
nel sito di inserzione
Una volta integrato nel genoma vegetale, il T_DNA, con tutto quel che
contiene, si comporta come il DNA della pianta, è stabile e viene
trasferito alla progenie