Kit di Implementazione per metodica FISH su campioni istologici e

Bio Optica Milano S.p.A. • via San Faustino 58 • I-20134 Milano
Tel. +39 02.21.27.13.1 • Fax Acquisti/Export +39 02.21.54.155
Fax Assistenza/Contabilità +39 02.26.41.74.48 • Fax Vendite +39 02.21.53.000
Kit di Implementazione per metodica FISH su
campioni istologici e citologici
Codice riassuntivo dei prodotti:
 Z-2028-20-PA (40 test: 20 campioni istologici e 20 campioni citologici)
Contenuto del kit:
.
Descrizione
Kit di implementazione per campioni istologici
Kit di implementazione per campioni citologici
Mastice sigillante per l’ibridazione
Vetrini porta oggetto a carica positiva
Vetrini coprioggetto 18 x 18 (piccoli, per ibridazione)
Vetrini coprioggetto 24 x 24 (grandi, per ibridazione)
Vetrini coprioggetto 24 x 40 (per montaggio DAPI)
Codice
Z-2028-20
Z-2099-20
E-4005-50
09-OPLUS
09-01818
09-02424
09-02440
Revisione 140703 del 03/07/14
Pagina 1 di 1
Quantità
1
1
1
1
1
1
1
ZytoLight
FISH tissue implementation Kit
Z-2028
20
Per metodiche di ibridazione in situ fluorescente
(FISH) utilizzando qualsiasi sonda per FISH della
ZytoVision
.
.
.
.
Dispositivo per uso diagnostico in vitro
in base alle direttive EU 98/79/EC
Ultima versione: 5 ottobre, 2009 (4.1)
Marchi di fabbrica
ZytoVision® e ZytoLight® sono marchi di ZytoVision GmbH.
Contenuto
1.
Finalità d'uso ...................................................................................... 1
2.
Principio del metodo ....................................................................... 1
3.
Informazioni su sicurezza e smaltimento ........................................ 2
4.
Il kit ZytoLight FISH Tissue Implementation Kit ................................. 3
4.1
Componenti ................................................................................ 3
4.2
Conservazione e validità ........................................................... 3
4.3
Campioni ......................................................................................... 3
4.4
Materiale supplementare necessario ..................................... 4
4.5
Informazioni importanti .............................................................. 5
5.
Protocollo ZytoLight tissue implementation Kit ............................. 6
5.1
5.2
Preparazione ............................................................................... 6
Pretrattamento (sparaffinatura/proteolisi) (1° giorno) ................. 6
5.3
Denaturazione e ibridazione (1° giorno) ....................................... 7
5.4
Post-ibridazione e rilevazione (2° giorno)...................................... 7
6.
Interpretazione dei risultati.............................................................. 9
7.
Bibliografia ....................................................................................... 10
8.
Problemi e possibili cause ............................................................. 11
1. Finalità d'uso
Il kit ZytoLight FISH Tissue Implementation Kit è stato studiato per rilevare
sequenze di DNA umano di tessuti inclusi in paraffina o cellule, fissati in
formalina attraverso ibridazione in situ fluorescente (FISH) utilizzando
una sonda per FISH ZytoVision.
L'interpretazione dei risultati deve essere effettuata da un patologo
qualificato tenendo conto degli altri dati clinici e patologici del
paziente nel contesto dell'anamnesi clinica.
2. Principio del metodo
La presenza di determinate sequenze di acido nucleico nelle cellule o
nei tessuti può essere rilevata attraverso ibridazione in situ con l'utilizzo di
sonde a DNA marcate. L'ibridazione induce la formazione di una
struttura a doppio filamento (ibrido duplex) tra le sequenze presenti nel
campione in analisi e la sonda.
Il kit ZytoLight FISH Tissue Implementation Kit può essere usato con una
qualsiasi sonda ZytoLight FISH venduta separatamente.
La formazione del duplex con la sonda marcata con fluoro cromi può
essere visualizzata attraverso l'utilizzo di un microscopio a fluorescenza
dotato degli adeguati filtri.
1
3. Informazioni su sicurezza e smaltimento

Leggere attentamente le istruzioni prima dell'uso!

Non utilizzare i reagenti dopo la data di scadenza!

Evitare contaminazioni incrociate e microbatteriche dei reagenti!

Alcuni componenti del sistema contengono (a basse
concentrazioni e volumi ridotti) sostanze nocive per la salute.
Evitare il contatto diretto con i reagenti. Adottare adeguate
misure di sicurezza (utilizzo di guanti monouso, occhiali protettivi e
indumenti da laboratorio)!

In caso di contatto con i reagenti, risciacquare immediatamente
la pelle con acqua corrente!

Non mettere in bocca le pipette per le soluzioni!

Smaltire i reagenti in base alle disposizioni locali!

La scheda di sicurezza è disponibile su richiesta per l'utilizzatore
professionale!
2
4. Il ZytoLight FISH Tissue Implementation Kit
4.1
Componenti
Il kit comprende i seguenti componenti:
Code Componenti
Tampone citrato per
PT1
pretrattamento termico
ES1 Pepsina
WB1 Tampone di lavaggio SSC
Tampone di lavaggio A,
WB2
25X
MT1 Dapi/antifade solution
Manuale d’istruzioni
Quantità Contenitore
500 ml Flacone con tappo a vite (grande)
4 ml
500 ml
Flacone contagocce, tappo bianco
Flacone con tappo a vite (grande)
2x 50 ml Flacone con tappo a vite
0,8 ml
1
Provetta con tappo blu
La sonda ZitoLight FISH non è compresa nel kit e deve essere acquistata
separatamente.
I componenti (ES1)e (MT1) sono sufficienti per 20 reazioni. I componenti
(WB2) sono sufficienti per allestire 10 set di 3 vaschette di capacità di 80
ml. I componenti (PT1) e (WB1)sono sufficienti per allestire 6 vaschette
da 80 ml.
4.2
Conservazione e validità
I componenti del kit devono essere conservati ad una temperatura
compresa tra 2-8°C, eccetto il DAPI/Antifade solution (MT1) che deve
essere conservata al buio a -16 – -22°C; è possibile conservare il
reagenti a 2-8°C per un breve periodo.
Osservando tali condizioni di conservazione, è possibile utilizzare il kit
almeno fino alla data di scadenza riportata sull'etichetta.
4.3
Campioni
Il kit ZytoLight FISH Tissue Implementation Kit è stato ottimizzato per
l'utilizzo su cellule e tessuti fissati in formalina ed inclusi in paraffina.
L'impiego di materiale fissato o incluso diversamente (es. strisci di
sangue o cellule fissate con metanolo-acido acetico glaciale) può
richiedere modifiche del protocollo da parte dell'utilizzatore. I nostri
esperti sono a disposizione per eventuali suggerimenti.
3
Si consiglia di preparare il tessuto nel modo seguente:

Fissazione in formalina neutra tamponata al 10% per 24 h a
temperatura ambiente.
Per ottenere una fissazione ed un'inclusione in paraffina ottimali ed
uniformi, la grandezza del campione non deve essere superiore a
0,5 cm3.

Procedimento standard e inclusione in paraffina
Utilizzare paraffina di alta qualità. L'infiltrazione e l'inclusione devono
avvenire ad una temperatura inferiore a 65°C.

Preparare sezioni con spessore di 2-5 µm
Utilizzare vetrini rivestiti di silano oppure altre sostanze, fissare per 2-16 h a
50-60°C.
4.4
Materiale supplementare necessario
I seguenti reagenti, materiali e strumenti non sono contenuti nel kit:
Sonda ZytoLight FISH
Xilene
Bagno termostatato (37°C, 98°C)
Piastra calda
Stufa per ibridazione
Vaschette di colorazione, 50-80 ml
Camera umida
Micropipetta (10 µl, 30 µl)
Pistola per incollaggio con adesivo a caldo o mastice(Fixogum
Etanolo 100% denaturato
Acqua distillata o deionizzata
Microscopio a fluorescenza
4
4.5
Informazioni importanti
Occorre tenere presente che:

Le sezioni non devono disidratarsi durante l'ibridazione ed i lavaggi!

Le sonde DNA e il DAPI/Antifade solution (MT1) non devono essere
esposti alla luce, specialmente alla luce diretta, per un lungo
periodo di tempo. Operare quindi, ove possibile, al buio e
utilizzanto contenitori opachi!

Le temperature di denaturazione e lavaggio descritte nel
protocollo devono essere utilizzate come guida. In base alla
fissazione dei campioni, una variazione di tali temperature
potrebbe produrre risultati migliori!

Questo protocollo è stato sviluppato per la denaturazione
simultanea di campione e sonda. Protocolli per denaturazioni
separate sono disponibile all’homepage www.zytovision.com!
5
5. Protocollo ZytoLight FISH Tissue
Implementation Kit
5.1
Preparazione
• 1° giorno:
Preparazione della scala di etanolo (70%, 90% e 100% etanolo): diluire 7,
9 e 10 parti di 100% etanolo con 3, 1 e 0 parti di acqua deionizzata o
distillata. Le soluzioni possono essere conservate in appositi contenitori e
riutilizzate.
Tampone citrato per pretrattamento termico (PT1) Riscaldare il
tampone in una vaschetta di colorazione coperta in acqua bollente
ad almeno 95°C.
Tampone di lavaggio SSC (WB1): Portare a temperatura ambiente
prima dell'utilizzo.
• 2° giorno:
Preparazione del Tampone di lavaggio A 1x: Diluire 1 parte di Tampone
di lavaggio A, 25X (WB1), con 24 parti di acqua distillata o deionizzata.
Riempire tre vaschette di colorazione con la soluzione ottenuta e preriscaldare a 37°C.
Dapi/antifade solution (MT1): portare a temperatura ambiente, al riparo
dalla luce.
5.2
Pretrattamento (sparaffinatura/proteolisi) (1° giorno)
1.
Incubare i vetrini per 10 min a 70°C (es. su una piastra riscaldante.)
2.
Incubare 2x 10 min in xilene
3.
Incubare 100%, 100%, 90% e 70% etanolo, per 5 minuti ciascuno
4.
Lavare 2x 2 min in acqua deionizzata o distillata.
5.
Incubare i vetrini per 15 min in Tampone citrato per pretrattamento
termico (PT1) precedemente riscaldato a 98°C.
Si raccomanda di non utilizzare più di sei vetrini per vaschetta.
6.
Trasferire direttamente i vetrini in acqua distillata e deionizzata,
lavare 2x 2min e asciugare il vetrino.
6
7.
Applicare tramite gocciolamento la Pepsina (ES1)sul preparato e
incubare per 10 min a 37°C in camera umida.
Il tempo di incubazione dipende dal tipo di campione, dallo spessore della sezione e
dal relativo tempo di fissazione. Come valore indicativo, si può considerare
un'incubazione di 10-30 min per campioni di tessuto e di 5-10 min per le cellule. In
generale, si consiglia di determinare il tempo di proteolisi ottimale eseguendo un test
preventivo.
8.
Lavare per 5 min in Tampone di lavaggio SSC (WB1) e per 1 min in
acqua distillata.
12.
Disidratare in etanolo 70%, 90% e 100%, ciascuno per 1 min.
Asciugare all'aria.
5.3
Denaturazione e ibridazione (1° giorno)
1.
Vortexare
campione.
la sonda Zytolight
FISH e pipettare
15 µl per ogni
Distribuire a piccole gocce sull'intera superficie evitando di concentrare
in un unico punto. Alternativamente, aggiungere la sonda al centro di
un coprioggetto e applicare il coprioggetto sull'area in esame. Un
leggero riscaldamento della sonda e l'utilizzo di un puntale tagliato in
punta semplificano l'operazione.
2.
Evitare la formazione di bolle, coprire con un coprioggetto (22 mm
x 22 mm; 24 mm x 32 mm). Sigillare il coprioggetto con adesivo o
mastice.
3.
Denaturare i campioni a 75 (±2°C) per 10 min, es. su una piastra
riscaldante.
4.
Trasferire i vetrini in una cameretta umida e ibridare overnight a
37°C (es. in un fornetto.)
E' indispensabile mantenere umido il campione durante l'ibridazione.
5.4
1.
Post-ibridazione e rilevazione (2° giorno)
Rimuovere con cura il mastice o la colla
2.
Rimuovere il coprioggetto immergendo il vetrino in Tampone di
lavaggio A 1x a 37°C per 5 min.
Il Tampone di lavaggio A deve essere pre-riscaldato. Verificare con un
termometro se necessario.
4.
Lavare 3x 2 min in acqua deionizzata o distillata.
5.
Disidratare in etanolo 70%, 90% e 100%, ciascuno per 1 min.
6.
Asciugare i vetrini all’aria.
7
7.
Applicare 30 µl di Dapi/antifade solution (MT1) sui vetrini evitando
la formazione di bolle, coprire il campione con un coprioggetto e
incubare per 15 min al buio.
Distribuire a piccole gocce sull'intera superficie evitando di concentrare in un unico
punto; l'utilizzo di un puntale tagliato in punta semplificano l'operazione. Evitare
l’esposizione alla luce
8.
Rimuovere gentilmente l’eccesso di Dapi/antifade solution (MT1)
9.
Conservare i vetrini al buio; per l’archiviazione di lungo periodo
conservare a 2-8°C
10. Osservare i campioni al microscopio a fluorescenza utilizzando
l’adeguato set di filtri.
8
6. Interpretazione dei risultati
Tramite l’uso dell’appropriato set di filtri, i segnali di ibridazione delle
sonde marcate ZyGreen appariranno verdi, i segnali di ibridazione delle
sonde ZyOrange appariranno arancioni.
Nell’interfase di cellule normali o di cellule prive di aberrazioni
cromosomiali, verrano visualizzati due segnali per sonda/segnale
fluorescente eccetto per le sonde che devono marecare i cromosomi
X e/o Y in cui si possono ottenere uno o due segnali a seconda del
sesso.
In cellule con aberrazioni cromosomiali un diverso pattern di segnale
verrà visualizzato.
I polinucleotidi contenuti nella sonda possono essere considerati come
controllo interno della avvenuta ibridazione, così come la prova
dell’integrità del DNA.
Per valutare la specificità del segnale, ogni ibridazione dovrebbe essere
accompagnata da vetrini di controllo.
Si raccomanda l’utilizzo di almeno un campione in cui si conosca il
numero di copie di cromosomi della regione bersaglio della sonda FISH
in uso.
Particolare attenzione si deve prestare nella valutazione di cellule
sovrapposte onde evitare falsi risultati tipo amplificazione del gene.
A causa della de condensazione della cromatina, singoli segnali FISH
possono apparire come piccoli cluster, comunque due o tre segnali
della stessa dimensione, separati da uno spazio pari alla dimensione di
un segnale, devono essere considerati come un unico segnale.
Un risultato negativo aspecifico può essere causato da diversi fattori,
fare riferimento al capitolo 8.
9
7. Bibliografia
Kievits T, et al. (1990) Cytogenet Cell Genet 53: 134-6.
Wilkinson DG: In Situ Hybridization, A Practical Approach, Oxford University Press (1992)
ISBN 0 19 963327 4.
10
8. Problemi e possibili cause
La mancata osservanza delle indicazioni contenute nelle istruzioni per
l'uso può produrre risultati deboli o mancanza di segnale.
Problema
Possibile causa
Azione
Crepe nel tessuto
in seguito al
trattamento con
pepsina
Formazione di precipitato
Lavare immediatamente i vetrini in
acqua deionizzata o distillata
Segnale scarso o
nullo
Nessuna sequenza target nel
materiale analizzato
Utilizzare controlli
Fissazione non ottimale delle
cellule o dei tessuti
Ottimizzare i tempi di fissazione
Tessuto iper- o ipo- digerito
Ottimizzare I tempi di trattamento
proteolitico
Temperatura di denaturazione
non appropriata
Verificare la temperatura; aggiustare
la temperatura, se necessario.
Temperatura di ibridazione non
corretta
Verificare la temperatura; aggiustare
la temperatura, se necessario.
Microscopio a fluorescenza non Regolare lo strumento
correttamente configurato
Colorazione
irregolare e molto
debole in alcune
zone
Sonda e vetrini esposti a luce
intensa
Evitare l’esposizione alla luce ove
possibile
Le sezioni non sono
correttamente sparaffinate
Utilizzare etanolo e xylene freschi;
utilizzare solo xylene “puro”.
Verificare i tempi di sparaffinatura.
Eccessivo volume di sonda per
Segnali di crossibridazione, intensa area
colorazione di
fondo
Distacco delle
sezioni dal vetrino
11
Ridurre il volume della sonda per area,
distribuire in modo uniforme la sonda
per evitare che si concentri
localmente
Eccessivo trattamento
proteolitico
Ottimizzare i tempi di incubazione
Disidratazione delle sezioni
durante i passaggi di
incubazione
Impedire disidratazione
Temperatura dei lavaggi postibridazione troppo bassa
Verificare la temperatura
Eccessivo pre-trattamento
proteolitico
Diminuire i tempi di incubazione
Rivestimento dei vetrini
inappropriato
Utilizzare vetrini appropriati
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Kit d i I m p l em e n t az io n e F IS H p er C ito l o gia
IVD Dispositivo medico-diagnostico in vitro
Produttore: ZytoVision GmbH
Codice:
 Z-2099-20 (20 test)
Per l’ibridazione in situ in fluorescenza (FISH) su campioni
citologici mediante sonde FISH ZytoLight.
Dispositivo Medico Diagnostico In Vitro
In ottemperanza alla direttiva UE 98/79/EC
Revisione 140324 del 24/03/14
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Fax Assistenza/Contabilità +39 02.26.41.74.48 Fax Vendite +39 02.21.53.000
A partire dal: 7 luglio 2010 (4.5)
Marchi registrati:
®
®
ZytoVision e ZytoLight sono marchi registrati di ZytoVision GmbH.
Revisione 140324 del 24/03/14
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Contenuto
1 Scopo dell’applicazione. ............................................................................. 4
2 Principi di base ........................................................................................... 4
3 Precauzioni di sicurezza e smaltimento....................................................... 5
4 Kit d’implementazione FISH ZytoLight per Citologia.................................... 6
4.1 Componenti ..................................................................................................... 6
4.2 Conservazione e validità. .......................................................................... 6
4.3 Campioni .................................................................................................. 7
4.4 Ulteriori Materiali. .................................................................................... 7
4.5 Informazioni Importanti............................................................................ 8
5 Protocollo del kit d’implementazione FISH ZytoLight per Citologia …........... 9
5.1 Passaggi preparatori .................................................................................. 9
5.2 Pretrattamento (Proteolisi/Post-Fissazione) [giorno 1]. ............................ 9
5.3 Denaturazione e Ibridazione [giorno 1].................................................... 10
5.4 Post Ibridazione e Visualizzazione [giorno 2] ........................................... 10
6 Interpretazione dei risultati. ...................................................................... 11
7 Letteratura. ........................................................................................................12
Revisione 140324 del 24/03/14
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Bio Optica Milano S.p.A. via San Faustino 58 I-20134 Milano
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Fax Assistenza/Contabilità +39 02.26.41.74.48 Fax Vendite +39 02.21.53.000
1. Scopo dell’applicazione
Il kit d’implementazione ZytoLight per Citologia è designato per la determinazione della
presenza di sequenza umane in campioni citologici mediante ibridazione in situ in
fluorescenza (FISH).
L’interpretazione dei risultati deve essere effettuata in un contesto di storia clinica del
paziente rispetto ad ulteriori informazioni relative a dati clinici e patologici del paziente da
un patologo qualificato.
2. Principi di Base
La presenza di determinate sequenze di acidi nucleici nelle cellule o nei tessuti può essere
determinata mediante ibridazione in situ utilizzando sonde a DNA marcate. I risultati
dell’ibridazione corrispondono ad una duplice presenza di sequenze presenti nel campione
in analisi e nella sonda a DNA.
Il kit d’implementazione per FISH ZytoLight per Citologia è destinato all’uso con qualsiasi
sonda FISH ZytoLight disponibile separatamente.
La formazione di segnali doppi delle sonde marcate in fluorescenza può essere visualizzata
utilizzando un microscopio in fluorescenza con appositi filtri.
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3. Precauzioni di sicurezza e smaltimento
 Leggere le istruzioni per l'uso prima dell’utilizzo!
 Non utilizzare i reagenti dopo che la data di scadenza è stata raggiunta!
 Evitare ogni contaminazione incrociata e contaminazione batterica dei reagenti!
 Alcuni dei componenti del sistema contengono sostanze (a basse concentrazioni e
volumi) che sono dannose per la salute. Evitare il contatto diretto con i reagenti.
Adottare idonee misure protettive (utilizzo di guanti monouso, occhiali protettivi e
indumenti da laboratorio)!
 Se i reagenti vengono a contatto con la pelle, lavare immediatamente la pelle con
abbondante quantità di acqua!
 Mai pipettare soluzioni con la bocca!
 Lo smaltimento dei reagenti deve essere effettuato in conformità con i regolamenti
locali!
 La scheda di sicurezza è disponibile su richiesta dell’utilizzatore professionale!
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4 Kit d’implementazione FISH ZytoLight per Citologia
4.1 Componenti
Il kit è costituito dai seguenti componenti:
Codice
ES2
WB5
PT4
PT5
WB7
WB8
MT1
Componente
Soluzione Pepsina Citologica
Buffer di lavaggio TBS 20X
MgCl2 10X
PBS 10X
Tampone di lavaggio stringenza
SSC per citologia
Tampone di lavaggio
SSC per citologia
Soluzione DAPI / antifade
Manuale di istruzioni
Quantità
4 ml
50 ml
50 ml
50 ml
500 ml
Confezionamento
Flacone contagocce, tappo trasparente
Bottiglia con tappo a vite
Bottiglia con tappo a vite
Bottiglia con tappo a vite
Bottiglia con tappo a vite (grande)
500 ml
Bottiglia con tappo a vite (grande)
0,8 ml
1
Provetta con tappo blu
I componenti (ES2) e (MT1) sono sufficienti per 20 reazioni. Componenti (PT4), (PT5), (WB7)
e (WB8) sono sufficienti per 7 contenitori per lavaggi da 70 ml ciascuno.
Il componente (WB5) è sufficiente per 14 contenitori per i lavaggi da 70 ml ciascuno.
4.2 Conservazione e validità
I componenti del kit devono essere conservati a +2 ... +8 ° C ad eccezione della soluzione
DAPI / Antifade (MT1) che deve essere conservata a -16 ... -22 ° C al buio; una
conservazione di breve durata a 2 ... 8 ° C è possibile.
Osservando tali condizioni di conservazione, il kit funzionerà, senza perdita di prestazioni,
almeno fino alla data di scadenza stampata sull'etichetta.
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4.3 Campioni
Il Kit di implementazione ZytoLight FISH per la Citologia è stato ottimizzato per l'uso su
metafasi e cellule in interfase da sangue periferico, colture, o direttamente su preparati
ottenuti con metodi citogenetici standard, vedere ad esempio: Beatty B, Mai S, Squire J (a
cura di): FISH a practical approach, Oxford University Press (2002). I nostri specialisti sono a
vostra disposizione per supportare qualsiasi messa a punto necessaria.
Si consiglia la seguente preparazione del campione:
Incubare i campioni durante la notte (12-16 h) a 37 ° C per l'invecchiamento
In alternativa, l'invecchiamento di campioni può essere realizzato mediante incubazione dei
vetrini per 2 min in 2X SSC a 73 ± 1 ° C immediatamente prima della proteolisi.
4.3 Ulteriori Materiali
I seguenti reagenti e materiali non sono inclusi nel kit:
- sonda FISH ZytoLight
- Bagnomaria (72 ± 1 ° C)
- Piastra calda
- Fornetto per ibridazione
- Vaschette di colorazione, 50-80 ml
- Camera umida
- Pipette (10 ml, 30 ml)
- Pistola per incollaggio con adesivo a caldo o mastice (Fixogum)
- Formaldeide, neutra tamponata
- Etanolo 100%, denaturato
- Acqua deionizzata o distillata
- Blocco di asciugatura
- Coprivetrini (22 millimetri x 22 mm, 24 mm x 60 mm)
- Microscopio a fluorescenza
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4.5 Informazioni Importanti
Le seguenti informazioni devono essere tenute a mente:
- I campioni citologici non devono asciugare durante l’ibridazione ed i lavaggi!
- La soluzione di formaldeide all’1% deve essere preparata prima dell'uso e dovrebbe
essere eliminata dopo l’utilizzo.
Le soluzioni non utilizzate possono essere conservate a +2 ... +8 ° C fino a 6 mesi.
- Sonda di DNA e la soluzione DAPI / Antifade (MT1) non dovrebbero essere esposti alla
luce, luce particolarmente forte. Tutti i passaggi dovrebbero essere realizzati, ove possibile,
al buio!
- La temperatura ed i tempi per i lavaggi descritti nel protocollo, devono essere seguiti con
precisione in quanto condizioni di lavaggio errate possono portare a nessun segnale o a
segnali deboli.
- Questo protocollo è progettato per la denaturazione simultanea di sonda e campione.
Protocolli per la denaturazione separata sono disponibili sulla nostra homepage
(www.zytovision.com)!
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Fax Assistenza/Contabilità +39 02.26.41.74.48 Fax Vendite +39 02.21.53.000
5 Protocollo del kit d’implementazione FISH ZytoLight
per Citologia
5.1 Passaggi preparatori
giorno 1
• Preparazione di una serie di alcoli (70%, 90%, e 100%):
Diluire 7, 9, e 10 parti di etanolo al 100% con 3, 1 e 0 parti di acqua deionizzata o acqua
distillata, rispettivamente. Queste soluzioni possono essere conservate in idonei
contenitori e riutilizzate.
• Preparazione di 1X Wash Buffer TBS: diluire 1 parte di 20x Wash Buffer TBS (WB5)
con 19 parti di acqua deionizzata o distillata.
• Preparazione della soluzione di formaldeide 1%: per 100 ml 1% formaldeide
Soluzione mix di 2,7 ml di formaldeide al 37% neutra tamponata o 10 ml del 10% di
formaldeide neutra tamponata con 10 ml di 10x MgCl2 (PT4) e 10 ml di PBS 10x (PT5) e
regolare il volume a 100 ml con acqua deionizzata o acqua distillata. Mescolare
accuratamente.
giorno 2
• Wash Buffer di stringenza per citologia SSC (WB7): Preriscaldare a 73 ± 1 ° C.
• Wash Buffer SSC per citologia (WB8): Portare a temperatura ambiente.
• Soluzione DAPI / Antifade (MT1): Portare a temperatura ambiente prima dell'uso,
proteggere dalla luce.
5.2
Pretrattamento (Proteolisi/Post-Fissazione) [giorno 1]
1.
Applicare (a gocce) la soluzione di pepsina per Citologia (ES2) ai campioni citologici e
incubare per 10 min a 37 ° C in una camera umida.
A seconda di molteplici fattori, ad esempio tipo e durata della fissazione nonché tipo di
cellule, possono essere richiesti diversi tempi di incubazione. Si consiglia un
tempo di incubazione di 5 - 15 min per campioni citologici. Come regola generale,
si consiglia di determinare il tempo di proteolisi ottimale eseguendo un test preventivo.
2. Incubare i vetrini per 5 min in 1x Wash Buffer TBS
3. Incubare i vetrini per 5 min in soluzione di formaldeide 1%
4. Incubare i vetrini per 5 min in 1x Wash Buffer TBS
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5. Disidratazione: etanolo 70%, 90% e 100%, 1 min per ciascuno.
Fare asciugare all'aria i campioni.
5.3
Denaturazione e Ibridazione [giorno 1]
1 Pipettare 10 ml di sonda ZytoLight su ciascun campione
Un leggero riscaldamento della sonda, come anche l’utilizzo di un puntale a cui è stata
tagliata la punta per aumentare la dimensione della apertura, può rendere il processo di
pipettaggio facile.
Evitare la lunga esposizione della sonda alla luce.
2 Evitare la formazione di bolle, coprire con un coprioggetto (22 mm x 22 mm). Sigillare il
coprioggetto, ad esempio con uno strato di colla a caldo da una pistola adesivo o con
mastice
3 Denaturare a 72 ± 1 ° C per 2 min, ad esempio su una piastra calda
4 Trasferire i vetrini in una camera umida e ibridare overnight a 37 ° C (ad esempio in un
fornetto)
E 'essenziale che i campioni citologici non si asciugano durante l'ibridazione.
5.4 Post Ibridazione e Visualizzazione [giorno 2]
Rimuovere con cura il mastice o la colla
Rimuovere con attenzione il vetrino
Lavare , utilizzando il tampone di stringenza SSC (WB7) per 2 min a 72 ± 1 ° C
Il buffer di stringenza SSC deve essere preriscaldato a 72 ± 1 ° C.
Verificare con un termometro se necessario.
Si consiglia di non utilizzare più di quattro vetrini per vaschetta di colorazione. Quando
necessario, usare vetrini vuoti per portare il numero a quattro.
Lavare , utilizzando il Wash Buffer SSC (WB8) per 1 minuto a temperatura ambiente.
Il Wash Buffer SSC deve essere portato a temperatura ambiente.
Verificare con un termometro se necessario.
Si consiglia di non utilizzare più di quattro vetrini per vaschetta di colorazione. Quando
necessario, usare vetrini vuoti per portare il numero a quattro.
Asciugare i campioni al riparo dalla luce.
Pipettare 30 µl di soluzione DAPI / Antifade (MT1) sui campioni.
Evitare la formazione di bolle, coprire con un coprioggetto (24 mm x 60 mm).
Incubare al buio per 15 minuti.
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Usare un puntale a cui è stata tagliata la punta per aumentare la dimensione della apertura
può rendere il processo di pipettaggio più semplice.
Evitare l'eccessiva esposizione alla luce.
Rimuovere l'eccesso di soluzione DAPI / Antifade (MT1) premendo delicatamente il vetrino
tra strati di carta.
Conservare i vetrini al buio.
Per periodi di conservazione lunghi mettere a 2-8 ° C.
Osservare il campione mediante microscopia a fluorescenza usando filtri appositi.
6 Interpretazione dei risultati
Con l'utilizzo di appositi set di filtri, in cellule interfasiche e metafasiche normali o cellule
senza aberrazioni cromosomiche, verranno osservati due segnali per ciascuna sonda
marcata in fluorescenza, eccetto per sonde che ibridino con il cromosoma X e / o Y.
Nelle cellule con aberrazioni cromosomiche , diversi pattern di segnale possono essere
visibili. Per una descrizione più dettagliata di pattern di segnali attesi consultare il manuale
relativo a ciascuna sonda.
I polinucleotidi contenuti in sonde FISH possono funzionare come controllo interno che
dimostri se è avvenuta l’ibridazione, nonché dimostrare l'integrità del DNA cellulare.
Per valutare la specificità dei segnali , ogni ibridazione dovrebbe essere corredata da
controlli. Si consiglia di utilizzare almeno un campione di controllo in cui sia noto il numero
di copie di regioni cromosomiche riconosciute dalla sonda FISH.
Si deve prestare attenzione a non valutare erroneamente le cellule sovrapposte , in modo
da evitare falsi risultati, ad esempio una amplificazione genica.
A causa della cromatina decondensata, singoli segnali possono apparire come cluster.
Due o tre segnali con le stesse dimensioni, separati da una distanza uguale o inferiore al
diametro di un segnale, devono essere considerati un singolo segnale.
Un risultato negativo o aspecifico può essere causato da molteplici fattori.
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6 Letteratura
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Scheda tecnica Fixogum
Fixogum, Rubber Cement
Notizie generali
Distributore:
BIO OPTICA Milano S.p.A.– Milano – Italy
Codice prodotto:
E-4005-125 formato da 125g
Descrizione:
Collante per sigillare il copri oggetto al vetrino portaoggetti, durante
ibridazione in situ . Compatibile con metodiche CISH e FISH.
Zytovision GmbH
Produttore:
Note di utilizzo
Campi di applicazione
CISH e FISH
Utilizzo
Aggiungere poche gocce di Fixogum per sigillare il copri oggetto al vetrino portaoggetti.
Lasciare asciugare.
Procedere come da metodica per ibridazione in situ (denaturazione e ibridazione).
Fixogum, Rubber Cement
Codice E-4005-125
Descrizione
Fixogum, Rubber Cement, 125g
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Bio Optica Milano s.p.a. • via San Faustino 58 • I - 20134 Milano • tel. +39 02212713.1 • fax +39 022153000 • www.bio-optica.it
Bio Optica Milano S.p.A. via San Faustino 58 I-20134
Milano Tel. +39 02.21.27.13.1 Fax Acquisti/Export +39
02.21.54.155
Ve t r ini p orta ogget t o S u p erFrost® P l u s
IVD Dispositivo medico-diagnostico in vitro
Codice CND: W0503900201
Notizie generali
Vetrini portaoggetto a carica positiva, di dimensioni 25 mm x 75
mm e 1 mm di spessore (ISO Norm 8037/I), molati a 90°.
Il rivestimento superficiale migliora l’adesione del tessuto al
vetrino.
Codice
09-OPLUS
Confezionamento
Colore banda
72 pezzi
Bianco
in scatola protettiva di plastica
Produttore: Gerhard Menzel, Glasbearbeitungswerk GmbH
Saarbrückener Str. 248 - D-38116 Braunschweig
Germany
Distributore:
Bio-Optica Milano S.p.A.
Caratteristiche chimiche e tecniche
Materiale:
extra white glass
Indice di rifrazione:
1.513 – 1.523 (misurato tra λ= 546.07 nm e λ= 643.85 nm)
Densità:
(2.47 ± 0.01) kg/dm
3
I vetrini portaoggetto Menzel sono puliti e sgrassati, trasparenti e privi di qualsiasi tipo di assorbimento selettivo.
La loro produzione è completamente automatizzata per eliminare sporcizia, polvere, incrinature e rotture;
garantisce inoltre vetri regolari nelle dimensioni e uniformemente piani.
L’elevata qualità delle materie prime garantisce lunga durata e stabilità nel tempo.
I portaoggetto Menzel sono resistenti a trattamenti enzimatici e al microonde (potenza consigliata: 750 - 800
watt).
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Composizione chimica
•
SiO2 (biossido di silicio): 72.20%;
•
Na2O (ossido di sodio): 14.30%;
•
K2O (ossido di potassio): 1.20%;
•
CaO (ossido di calcio): 6.40%;
•
MgO (ossido di magnesio): 4.30%;
•
Al2O3 (ossido di alluminio): 1.20%;
•
Fe2O3 (ossido di ferro): 0.03%;
•
SO3 (triossido di zolfo): 0.30%.
Caratteristiche funzionali
I vetrini Superfrost Plus sono prodotti con un processo che:
• riveste con una carica positiva permanente i vetrini standard;
• attrae elettrostaticamente le sezioni criostatate e i preparati citologici, legandoli al vetrino;
• induce la formazione di legami covalenti tra i campioni fissati in formalina e il vetrino.
Il trattamento elettrostatico, che carica positivamente e in modo permanente la superficie del vetrino, garantisce
l’adesione del campione.
Con i vetrini Superfrost Plus, non rimane la colorazione di fondo dovuta alla carica positiva del vetro:
•
Assenza di fondo blu o rosso con ematossilina ed eosina, che si forma invece utilizzando normali vetrini con
film adesivo.
•
Assenza di fondo marrone con immunoperossidasi e procedure di ibridazione in-situ.
•
Ottima adesione delle sezioni con trattamenti di digestione enzimatica, denaturazione di DNA e ibridazione
di RNA.
•
I vetrini Superfrost Plus sono RNAsi-free.
Modalità di conservazione e stoccaggio
•
Conservare i vetrini in luogo fresco e asciutto.
•
Evitare i grandi sbalzi di temperatura durante lo stoccaggio e l’uso. Un raffreddamento del prodotto può
causare condensazione con formazione di acqua condensata tra i vetrini.
•
Proteggere dall’umidità.
•
Validità del prodotto: 1 anno. Si consiglia di controllare sempre la validità del prodotto sulla confezione.
•
Smaltimento: da smaltire in conformità con la normativa vigente. Se non utilizzati, smaltire come vetro
comune.
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Ve t r ini C opri ogget t o
IVD Dispositivo medico-diagnostico in vitro
Codice CND: W0503900202
Notizie generali
Vetrini coprioggetto per microscopia.
Codice
Dimensioni (mm)
Confezionamento
09-01818
18 x 18
1000 pz. (5 scatole da 200 vetrini l’una)
09-01824
18 x 24
1000 pz. (5 scatole da 200 vetrini l’una)
09-02020
20 x 20
1000 pz. (5 scatole da 200 vetrini l’una)
09-02126
21 x 26
1000 pz. (10 scatole da 100 vetri l’una)
09-02222
22 x 22
1000 pz. (5 scatole da 200 vetrini l’una)
09-02232
22 x 32
1000 pz. (10 scatole da 100 vetri l’una)
09-02240
22 x 40
1000 pz. (10 scatole da 100 vetri l’una)
09-02250
22 x 50
1000 pz. (10 scatole da 100 vetri l’una)
09-02424
24 x 24
1000 pz. (5 scatole da 200 vetrini l’una)
09-02432
24 x 32
1000 pz. (10 scatole da 100 vetri l’una)
09-02440
24 x 40
1000 pz. (10 scatole da 100 vetri l’una)
09-02450
24 x 50
1000 pz. (10 scatole da 100 vetri l’una)
09-02460
24 x 60
1000 pz. (10 scatole da 100 vetri l’una)
09-05065
50 x 65
1000 pz. (10 scatole da 100 vetri l’una)
09-030
Ø 30
1000 pz. (10 scatole da 100 vetri l’una)
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02.21.54.155
Produttore:
Menzel Gläser – Gerhard Menzel, Glasbearbeitungswerk GmbH & Co. KG
Saarbrückener Str. 248
D-38116 Braunschweig
Germany
Distributore:
Bio-Optica Milano S.p.A.
Caratteristiche funzionali
Materiale:
vetro idrolitico classe 1
Indice di rifrazione:
1.513 – 1.523 (misurato tra λ= 546.07 nm e λ= 643.85 nm)
Spessore dei vetrini:
0.13 – 0.16 mm
I vetrini coprioggetto BIO-OPTICA sono uniformemente piani, esenti da rigature, bolle o striature, garantendo
un’elevata qualità ottica.
La loro produzione è completamente automatizzata per eliminare sporcizia, polvere, incrinature e rotture
L’elevata qualità delle materie prime garantisce inoltre lunga durata e stabilità nel tempo.
I vetrini coprioggetto sono confezionati in scatole di plastica antiurto che ne preserva l’integrità fino all’utilizzo.
Modalità di conservazione e stoccaggio
• Conservare i vetrini in luogo fresco e asciutto.
• Evitare i grandi sbalzi di temperatura durante lo stoccaggio e l’uso. Un raffreddamento del prodotto può
causare condensazione con formazione di acqua condensata tra i vetrini.
•
Proteggere dall’umidità
NB: E’ possibile, su richiesta, preparare vetrini di dimensioni particolari.
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