Bacillus clausii - Dipartimento di Matematica e Applicazioni "Renato

CONVITTO NAZIONALE
“Vittorio Emanuele II”
LICEO CLASSICO EUROPEO - LICEO SCIENTIFICO
Progetto Lauree Scientifiche
‘’Bacillus clausii’’
Modelli matematici
Cos’è un modello matematico? Come si realizza?
• Osservazione di un fenomeno;
Il modello matematico è una
descrizione semplificata di
• Selezione dei parametri
fenomeni reali espressi in termini
rilevanti;
matematici.
• Formulazione delle equazioni;
• Analisi delle equazioni stesse;
Trovano la loro applicazione in
• Confronto con i dati
vari campi come la biologia, la
sperimentali.
meteorologia, la climatologia e
l’economia.
Prima fase:
osservazione del fenomeno
L’osservazione del fenomeno è effettuata attraverso misure,
rilevazioni, esperimenti, censimenti…
Nel nostro caso si è osservata la crescita di organismi cellulari
effettuata in laboratorio.
Seconda fase:
selezione dei parametri rilevanti
La legge di crescita batterica permette di individuare
immediatamente i parametri rilevanti:
•𝑎𝑛 = popolazione al tempo 𝑡 = 𝑛 (con 𝑎𝑛 ≥ 0);
• 𝑡 =tempo definito come “salto generazionale”;
•𝑉𝑛,𝑚 = velocità media definita come rapporto tra la variazione di
popolazione e il tempo in cui avviene
𝑉𝑛,𝑚 =
(𝑎𝑛+1 – 𝑎𝑛 )
1
Terza fase:
formulazione dell’equazione
A questo punto si tenta di costruire un modello, ipotizzando che la
variazione della popolazione batterica sia proporzionale alla
popolazione stessa al tempo 𝑛.
Detto tasso di crescita:
𝑉𝑚 𝑎𝑛+1 – 𝑎𝑛
𝑘𝑛 = =
𝑎𝑛
𝑎𝑛
Si ottiene:
𝑎𝑛+1 = (1+ 𝑘𝑛 ) 𝑎𝑛
Equazione alle differenze che rappresenta un possibile modello che
varia in base al tasso di crescita.
Terza fase:
formulazione dell’equazione
Studiamo il comportamento del modello in base al tasso di
crescita. Se il tasso è costante, ovvero:
𝑘𝑛 = 𝑘
il modello che otteniamo è:
𝑎𝑛+1 = (1 + 𝑘)𝑎𝑛
che viene detto ‘’modello di Malthus’’ o di crescita geometrica.
𝑎0 = 𝑎
Terza fase:
formulazione dell’equazione
Se invece il tasso di crescita è dato da
𝑘𝑛 = ℎ 𝑀 − 𝑎𝑛+1
dove 𝑀 rappresenta la ‘’capacità di accoglienza dell’ambiente’’ il
modello diventa
𝑎𝑛+1 − 𝑎𝑛 = ℎ(𝑀 − 𝑎𝑛+1 )𝑎𝑛
𝑎0 = 𝛼
Che si può chiamare ‘’logistico’’
Quarta fase:
analisi delle equazioni stesse
Formulato il modello, proviamo a studiarlo.
Nel caso del modello di Malthus, utilizzando il principio di
induzione, si ottiene:
𝑎𝑛 = (1 + 𝑘)𝑛 𝛼
Il comportamento della popolazione dipende da k.
Quarta fase:
analisi delle equazioni stesse
Osserviamo ora il comportamento dell’equazione al variare di 𝑘 .
Dovendo essere 𝑎𝑛 ≥ 0per ogni 𝑛 ≥ 0
Deve essere 𝑘 ≥ −1
ma 𝑘 = −1 comporta 𝑎𝑛 = 0 per ogni 𝑛 ≥ 0 quindi non si
considera;
𝑘 = 0 comporta 𝑎𝑛 = 𝑎0 costantemente “crescita zero”;
𝑘 > 0 ⇒ 𝑘 + 1 > 1 ⇒ popolazione in crescita;
−1 < 𝑘 < 0 ⇒ 0 < 𝑘 + 1 < 1 ⇒ popolazione in diminuzione.
GRAFICI DI CRESCITA GEOMETRICA
Quarta fase:
analisi delle equazioni stesse
Nel caso del modello logistico, effettuando opportuni calcoli, si
ottiene
𝑎0 𝑀(1 + ℎ𝑀)𝑛
𝑎𝑛 =
𝑀 − 𝑎0 + 𝑎0 (1 + ℎ𝑀)𝑛
I punti della successione 𝑎𝑛 si trovano su una curva detta
‘’curva logistica‘’o sigmoide, che descrive una curva ad S di
crescita di alcuni tipi di popolazioni P. All'inizio la crescita è
quasi esponenziale, successivamente rallenta, diventando
quasi lineare, per raggiungere una posizione asintotica dove la
crescita è molto lenta.
Grafico di una curva
logistica
Quinta fase:
confronto con i dati sperimentali
A questo punto si confrontano i dati determinati con le equazioni
formulate con i dati ottenuti sperimentalmente.
Troveremo che il nostro modello rientra nel modello logistico,
come si vedrà dal grafico ottenuto con le misurazioni effettuate.
Costruzione della curva di crescita del
Bacillus clausii
Scopo: verificare la crescita esponenziale del numero
di unità formanti colonie (U.F.C.) in una coltura di un
probiotico
Richiami teorici: il B. clausii è un microrganismo Grampositivo, mobile, sporigeno e aerobio. Esso vive nel suolo e
viene utilizzato come probiotico. È a forma di bastoncello e
cresce in gruppi o in colonie. È alcalofilo (vive in ambienti
alcalini o basici). È capace di produrre alcune proteasi
(subtilisine) attive in ambienti alcalini.
Le spore sono in grado di germinare, generando le
forme vegetative, se vengono mantenute per
almeno 12 ore a 40 °𝐶in un brodo di coltura come
l'acqua peptonata oppure se vengono poste
direttamente su un terreno solido come il Plate
Count Agar.
Il tempo medio di generazione del Bacillus clausii è di
circa 30 minuti.
L'intorbidimento dell'acqua peptonata dimostra la
germinazione delle spore di B. clausii.
Acqua peptonata
pura
Acqua peptonata
con batteri
Bagnetto termostatato
La comparsa di
colonie,
cremose e di
color avorio,
leggermente in
rilievo, di forma
tondeggiante,
con margini
netti dimostra
la
germinazione
delle spore sul
terreno solido
utilizzato.
Strumenti e materiali adoperati
STRUMENTI
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Pipette Pasteur
Provette
Becher
Termometro
Capsule di Petri
Spatola
Bagnetto termostatato
Stufa termostatata
Distillatore
Becco di Bunzen
Spargifiamma
Contacolonie
Piastra riscaldante
Imbuto
Bilancia analitica
MATERIALI
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Spore di Bacillus clausii
Soluzione fisiologica
Acqua distillata
Acqua peptonata
Plate Count Agar
Trypton Soy Agar
Corrente elettrica
Procedimento operativo
PREPARAZIONE DEL BRODO DI COLTURA

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Distillare 150 ml di acqua (fig. 1)
Pesare sulla bilancia analitica 2,25 grammi di acqua
peptonata liofilizzata (fig. 2)


Sciogliere la polvere pesata in 150 ml di acqua
distillata (fig. 3)
Riscaldare leggermente agitando di frequente e
sterilizzare mediante pastorizzazione (fig. 4)

Versare nelle provette (fig. 5)
Fig. 1
Fig. 2
Fig. 3
Fig. 5
Fig. 4
PREPARAZIONE DEL TERRENO DI COLTURA


Distillare 150 ml di acqua (fig. 6)
Pesare sulla bilancia analitica 3,525 g di Plate Count
Agar liofilizzato (fig. 7)

Sciogliere la polvere pesata in 150 ml di acqua
distillata (fig. 8)


Riscaldare agitando frequentemente (fig. 9)
Lasciar bollire per un minuto per sterilizzare
mediante pastorizzazione (fig. 10)

Versare nelle capsule di Petri (fig. 11)
Fig. 6
Fig. 7
Fig. 9
Fig. 8
Fig. 10
Fig. 11
DILUIZIONE
Per ottenere colonie singole facilmente contabili è
necessario sottoporre il campione di partenza a diluizioni
successive in modo da ridurre la concentrazione delle cellule.
Preparare le diluizioni decimali a scalare in questo modo:
miscelare il campione in esame per distribuire
uniformemente i microrganismi e trasferire, con pipetta
sterile, 1 ml del campione nella prima di una serie di
provette contenenti 9 ml di soluzione fisiologica,
omogeneizzando il campione nel diluente (fig. 12). Si ottiene
in tal modo la diluizione 1:10.
Procedere analogamente fino ad ottenere la diluizione
1: 107 .

Fig. 12
PIASTRATURA (PER INCLUSIONE)
Prelevare 1 ml dall'ultima diluizione e versarlo in una
capsula di Petri
°
 Versare l'Agar mantenuto fuso a 45 𝐶, nella capsula
di Petri (fig. 13)
 Ruotare delicatamente la piastra per miscelare il
terreno
 Aspettare la solidificazione del terreno
 Capovolgerlo e incubarlo nella stufa termostata a
40 °𝐶 (fig. 14)
 Dopo la fase di latenza durata circa 7 ore, si iniziano a
contare le U.F.C ad intervalli regolari di 30 minuti

Fig. 13
Fig. 14
CONTEGGIO IN PIASTRA
Il metodo della conta in piastra presenta un elevato
grado di sensibilità permettendo di rilevare un numero
piccolo di organismi presenti nella sospensione. La
possibilità di registrare un numero di microrganismi il
più vicino possibile al numero reale dipende da una
serie di fattori soprattutto di tipo operativo.
 La crescita in piastra richiede tempi di attesa
piuttosto lunghi determinati dalla durata
dell'incubazione necessaria per evidenziare colonie
visibili.
 Il numero di microrganismi viene determinato
moltiplicando il numero di colonie per l’inverso del
fattore di diluizione.

Conteggio in piastra
Visuale del contacolonie
RISULTATI CONTEGGIO
I primi risultati ottenuti sono stati i seguenti:
𝑡0 : (38 ± 1) × 106 U.F.C./1 ml
𝑡1 : (80 ± 1) × 106 U.F.C./1 ml
𝑡2 : (152 ± 1) × 106 U.F.C./1 ml
𝑡3 : (272 ± 1) × 106 U.F.C./1 ml
𝑡4 : (416 ± 1) × 106 U.F.C./1 ml
Rieseguiamo le diluizioni, la piastratura e il conteggio
una seconda volta.
Otteniamo i seguenti risultati:
FASE DI LATENZA (7 ORE) : 40 U.F.C./1 ml
𝑡0 : 1760 U.F.C./1 ml
𝑡1 : 3530 U.F.C./1 ml
𝑡2 : 7020 U.F.C./1 ml
𝑡3 : 14060 U.F.C./1 ml
𝑡4 : 28160 U.F.C./1 ml
𝑡5 : 56500 U.F.C./1 ml
𝑡6 : 112600 U.F.C./1 ml
𝑡7 : 225270 U.F.C./1 ml
𝑡8 : 275560 U.F.C./1 ml
𝑡9 : 285060 U.F.C./1 ml
CONCLUSIONI
Utilizzando i valori di U.F.C. nel tempo si ottiene il grafico
seguente: si evidenzia una lunga fase di latenza dovuta,
probabilmente, alla germinazione delle spore e
all'adattamento delle cellule batteriche al terreno di coltura;
alla fase di latenza segue una fase di crescita in cui il numero
di U.F.C. aumenta rapidamente nel tempo.
Gli ultimi due punti del grafico evidenziano un numero molto
simile di U.F.C.
Il numero delle colonie non aumenta, poiché è stato raggiunto
un equilibrio tra le colonie che sopravvivono e quelle che
muoiono. Se avessimo proseguito nel contare le colonie,
avremmo notato una diminuzione nel numero di U.F.C.
dovuta all’aumento del numero di colonie morte a scapito di
quelle vive.
Curva di crescita di Bacillus clausii
300000
285060
275560
250000
225270
NUMERO DI U.F.C.
200000
150000
112600
100000
56500
50000
28160
0
40
40
40
40
40
40
40
1
2
3
4
5
6
7
(LAT.) (LAT.) (LAT.) (LAT.) (LAT.) (LAT.) (LAT.)
7020
1760 3530
t0
t1
t2
TEMPO (ORE)
14060
t3
t4
t5
t6
t7
t8
t9
CONVITTO NAZIONALE
“Vittorio Emanuele II”
LICEO CLASSICO EUROPEO - LICEO SCIENTIFICO
Prof.ssa Annamaria Salvemini
A cura di:
Giulia Andreucci
Maria Cristina D’Alessandro
Giulio Cristian D’Anna
Flavia Martinelli
Filomena Pellino
Anna Maria Petrone
Ramona Raiola
Maria Sofia Troise
Hanno collaborato realizzando l’esperimento gli allievi della classe III LS e la prof.ssa
Maria Pia Di Grado.
Realizzazione grafica e stesura della sezione scientifica a
cura di Emanuele Rossitto