lezione 7

CORSO DI LAUREA SPECIALISTICA IN BIOTECNOLOGIE DEL
FARMACO
Adriana Maggi
BIOTECNOLOGIE FARMACOLOGICHE
LEZIONE 7
Proteine terapeutiche
Proteine terapeutiche
•
•
•
Il numero di proteine terapeutiche attualmente in
commercio supera i 250.
I farmaci biotecnologici che vengono utilizzati
per 384 indicazioni di cui 200 sono nuove terapie
Attualmente ci sono più di 400 prodotti
terapeutici biotecnologici in trial clinici. I farmaci
in studio sono per la terapia di diversi tipi di
neoplasie, Alzheimer, malattie cardiovascolari,
diabete, sclerosi multipla, AIDS e artrite.
Biotechnology Industry Organization (BIO)
Proteine terapeutiche
Proteine di I generazione identiche alle proteine
endogene umane
Proteine di II generazione modificate al fine di:
-
Migliorarne le caratteristiche farmacocinetica
(diminuire la biodegradabilità, aumentare la
penetrazione cellulare, ecc)
Generare prodotti innvativi con funzioni
diverse da quelle originarie
Generare dei prodotti più stabili facilitandone
la conservazione
Biosimilari
Proteine terapeutiche - Svantaggi
1.
2.
3.
4.
5.
6.
nuove metodologie di produzione
riproducibilità nella produzione
purificazione della macromolecola di
sintesi
contaminanti nella purificazione
stabilità del prodotto finito
vie di somministrazione e farmacocinetica
Proteine terapeutiche – Vantaggi
1. Generalmente esercitano una attività estremamente
mirata e specifica
2. Data la loro specificità hanno limitati effetti
collaterali indesiderati
3. Data la loro alta specificità ed essendo di origine
umana sono generalmente ben tollerati
4. Possono sopperire a un difetto genetico – nuovi
bersagli terapeutici
5. Il tempo di approvazione da parte delle autorità
regolatorie è significativamente inferiore a quello di
molecole di sintesi (1 anno per 33 proteine/ 294 piccole
molecole approvate tra 1980 e 2002 )
6. La protezione brevettuale può essere più lunga di
altri composti per le difficoltà di ottenere prodotti
biosimilari
RICERCA PRECLINICA E FARMACI BIOTEC
DRUG DISCOVERY:
- scelta del bersaglio biologico
- scelta dell’origine della molecola a potenziale attivita’
farmacologica (lead compound)
- identificazione della molecola attiva sul bersaglio
mediante opportuno screening
FORMULAZIONE FARMACEUTICA
FARMACOCINETICA E METABOLISMO
FARMACOLOGIA GENERALE
TOSSICOLOGIA
FORMULAZIONE DEL DOSSIER PER INIZIO
SPERIMENTAZIONE CLINICA
Farmaci biotecnologici
A fronte di un mercato farmaceutico in
crescita del 7% rispetto al 2006, il mercato
dei farmaci biotecnologici è cresciuto del
17.9% e oggi è pari a 65 miliardi di dollari
(circa il 10% del mercato dei farmaci
globale), inoltre due prodotti Biotech,
Aranesp e Enbrel, sono state tra i primi dieci
farmaci più venduti nel mondo nel 2006.
INSULINA
INSULINA
ormone polipeptico prodotto
dalle cellule b del pancreas
SINTESI E MATURAZIONE DELL’INSULINA
PREPROINSULINA
RETICOLO ENDOPLASMATICO
PROINSULINA
peptide C
GRANULI DI SECREZIONE DEL GOLGI
catena A
(21aa)
catena B
(30aa)
aa 51
peptide
segnale
PRODUZIONE DI INSULINA
PANCREAS DI MAIALE
ESTRAZIONE E
PURIFICAZIONE
1921-Scoperta dell’insulina
(Banting e Best) e sua
produzione per
estrazione dal pancreas
bovino o porcino
insulina A 8
A 10 B 30
umana
Thr Ile
Thr
suina
Thr Ile
Ala
bovina
Ala
Ala
Val
PRODUZIONE DI INSULINA
1921- 1980:
DIMERI DI INSULINA
Zn++
Zn++
ESAMERO DI INSULINA
 Aumento stabilità chimica delle
preparazioni di insulina con Zn++
e con formulazioni neutre (in
ambiente acido avvengono
reazioni di deamidazione)
 Ottimizzazione tecniche estrattive
e di purificazione (cromatografie)
PRODUZIONE DI INSULINA
catena
B
Conversione
enzimatica insulina
SUINA in UMANA
SEFADEX
Digestione con
tripsina pH7.5
Gly23 e Arg22
Prodotto
di
digestione
+
Octapeptide Cterminale
insulina umana
sintetizzato
chimicamente
da 10g di insulina
suina ne vengono
prodotti 7 di umana
PRODUZIONE DI INSULINA
PLASMIDE
D’ESPRESSIONE
GENE
INSULINA
UMANA
1982
DNA RICOMBINANTE
VANTAGGI
E.COLI
REAZIONI
IMMUNITARIE
ESTRAZIONE E PURIFICAZIONE
ELIMINAZIONE
USO ANIMALI
PRODUZIONE DI INSULINA
GENENTECH: produzione in E.Coli di catene A e B
separate e poi incubate in ambiente ossidativo per
formare i ponti disolfuro
E.COLI
A
B
PRODUZIONE DI INSULINA
ELYLILLY
FERMENTAZIONE
INSULINA
ALTAMENTE PURIFICATA
recupero delle cellule
RP-HPLC
PROINSULINA CRUDA
INSULINA PURIFICATA
colonne di
scambio ionico
cristallizzazione
PROINSULINA PARZIALMENTE
PURIFICATA
proteolisi
enzimatica
gel filtrazione
INSULINA CRUDA
MODIFICAZIONI DELL’ INSULINA
Residui aa che interagiscono con il
recettore e importanti per la
dimerizzazione:
A1,A4,A5,A19,A21
B12,B16,B23,B24,B25,B26
l’inserzione di un aa
la conversione di
carico promuove la
HisB10 in Glu aumenta
repulsione fra
l’attività di 5 volte monomeri (fast acting
insulin aspart)
STRATEGIE INNOVATIVE DELL’INSULINA
INSULINA GLARGINA
L’aumento del punto isoelettrico dell’insulina da 5.4 verso la
neutralità (due arginine vengono aggiunte all’N-term. di B),
causando la precipitazione nel sito d’iniezione, provoca un
ritardo nell’assorbimento ed un prolungamento dell’effetto
INSULINA DETEMIR
L’acilazione covalente della LysB29 promuove il legame
reversibile dell’insulina all’albumina ritardandone la
distribuzione e il trasporto transendoteliale
TISSUE
PLASMINOGEN
ACTIVATOR: t-PA
L’INFARTO ACUTO AL MIOCARDIO (AMI) E ’LA
PIU’ COMUNE CAUSA DI MORTE NEGLI STATI
UNITI
Di solito l’infarto e’ dovuto ad occlusione di arterie
coronarie causata dalla formazione di un trombo di una
placca aterosclerotica.
Studi clinici hanno dimostrato che la lisi dei trombi con
attivatori del plasminogeno diminuisce la mortalita’.
FARMACI USATI PER AMI:
•STREPTOCHINASI
•ANISTREPLASI
•UROCHINASI
•T-PA
placca
lume
FARMACI TROMBOLITICI
La terapia con farmaci trombolitici tende a
dissolvere i trombi e i depositi di fibrina nei
siti dove è avvenuto un danno vascolare.
Ovviamente tutti questi farmaci sono
altamente tossici perché provocano
emorragie.
LIMITI DEL TRATTAMENTO
INCAPACITA’ DI LISARE UNA SIGNIFICATIVA
PROPORZIONE DI TROMBI CORONARICI
COMPLICANZE
EMORRAGICHE
NONOSTANTE L’IMPIEGO DEGLI AGENTI TROMBOLITICI
ATTUALMENTE DISPONIBILI IL 45% DEI PAZIENTI NON PRESENTA
DOPO 90’ UN RIPRISTINO COMPLETO DEL FLUSSO CORONARICO A
CAUSA:
•COMPLESSITA’ STRUTTURALE DELLA PLACCA ATEROSCLEROTICA
SU CUI SI FORMA IL TROMBO CORONARICO OCCLUDENTE
•REGIME TERAPEUTICO
LA COAGULAZIONE
LA FIBRINOLISI
t-PA
PAI-1 E PAI-2
PLASMINA
(enzima fibrinolitico)
PLASMINOGENO
(proenzima)
FIBRINA
a2-ANTIPLASMINA
PRODOTTI DEGRADATI
Il t-PA viene prodotto dalle cellule
endoteliali e attiva il plasminogeno con
taglio enzimatico all’Arg560
t-PA
Plasminogeno legato
alla fibrina
Plasmina legata
alla fibrina
Degradazione fibrina
Cellule endoteliali
trombo
STRUTTURA t-PA
•SERIN PROTEASI
•aa 527 (64kD)
•17 PONTI DISOLFURO
•4 N-GLICOSILAZIONI
•2 FORME (CON/SENZA
GLICOSILAZIONE
ASP184)
FINGER
Nel corso della fibrinolisi la
FIBRINA depositata nel
coagulo
lega il t-PA e lo attiva
TAGLIO
KRINGLE
SERINPROTEASE
Viene scisso legame Arg275-Ile276
catena pesante N-terminale
responsabile del legame alla
fibrina
catena leggera C-terminale
responabile dell’attività
catalitica
•DOMINIO FINGER
•DOMINIO EGF-LIKE
•DUE KRINGLE
•DOMINIO SERIN PROTEASI
His-Asp-Ser che taglia il
plasminogeno
PRODOTTI COMMERCIALIZZATI
Nome
Alteplase
Alteplase
Reteplase
Tene
cteplase
Nome
Commerciale
Activase
Catfhlo
Activase
Ratavase
TNKase
Casa
Produttrice
Genentech
Genentech
Boehringer
Mannheim
Genentech
Infarto acuto
del miocardio
(AMI) con
aumento della
funzione
ventricolare in
seguito
all’evento
Riduzione della
mortalità
associata
all’infarto del
miocardio
acuto(AMI)
Uso
terapeutico
Infarto
acuto del
miocardio
(AMI)
Ripristino della
funzionalità
cateteri
vascolari
PRODOTTO A UNA O
DUE CATENE IN CHO
EMIVITA
<5MIN
IDENTICO
ALL’ENDOGENO t-PA
UMANO
ALTEPLASE
SOMMINISTRAZIONE I.V. DOSE
RACCOMANDATA: 0.9 mg/kg
PER INFUSIONE DI 60’, IL 10%
DI FARMACO DEVE ESSERE
INIETTATO IN BOLO IN 1’
LA CLEARANCE EPATICA E’ RECETTORE
MEDIATA: LE CELLULE DEL KUPPFER E
ENDOTELIALI ATTRAVERSO IL
RECETTORE DEL MANNOSIO, GLI
EPATOCITI CON UN RECETTORE
CARBOIDRATO INDIPENDENTE
RETEPLASE (2
MUTANTE DI DELEZIONE (MANCA
KRINGLE 1 , FINGER E EGFLIKE DOMAINS)
NON GLICOSILATO
AUMENTA L’EMIVITA
(15 MIN)
DIMINUISCE IL
LEGAME CON LA
FIBRINA
PRODOTTO IN E.COLI
a
generazione)
TENECTEPLASE
SOSTITUZIONI AMINOACIDICHE IN DUE PUNTI DEL
KRINGLE 1 AUMENTANO LA SPECIFICITA’ CON LA
FIBRINA E DIMINUISCONO LA CLEARANCE
PLASMATICA PROLUNGANDO L’EMIVITA (17 min)
GLY PER ASN 117
QUATTRO SOSTITUZIONI
AMINOACIDICHE NEL SITO
CATALITICO AUMENTANO
RESISTENZA AL PAI-1 E
AUMENTANO LA SPECIFICITA’
CON LA FIBRINA
ASN PER THR A 103
ALA-ALA-ALA-ALA
PER LYS-HIS-ARG-ARG
A 296-299
NUOVE PROSPETTIVE:
LANOTEPLASE
MUTANTE DI DELEZIONE DEL t-PA
NATIVO (MANCA DEL FINGER E
EGF LIKE DOMAIN)+MUTAZIONE
PUNTIFORME DA ASN117 A GLN
QUESTA MODIFICAZIONE EVITA LA
CLEARANCE DA PARTE DEI REC
PER IL MANNOSIO EPATICI
PROLUNGANDO L’EMIVITA A 10’
PRODOTTO IN CH
Proteine terapeutiche di I e II generazione: una
nuova classificazione funzionale
Leader et al. Nature Reviews Drug Discovery
7: 21-35, 2008
PROTEINE TERAPEUTICHE –classificazione
funzionale
Gruppo I: proteine terapeutiche con attività enzimatica o regolatoria
1a che rimpiazzano una proteina deficiente o anormale
1b che aumentano attività esistenti
1c che danno nuove funzioni/attività
Gruppo II: proteine terapeutiche con bersagli mirati
2a che interferiscono con l’attività fisio-patologiche
2b che rilasciano un composto terapeutico in un distretto specifico
Gruppo III: vaccini proteici
3a che proteggono nei confronti di microorganismi esterni
3b per il trattamento di malattie autoimmuni
3c per la terapia anti-neoplastica
Gruppo IV proteine con attività diagnostica
Gruppo I
proteine terapeutiche con attività enzimatica o
regolatoria
1a che rimpiazzano una proteina deficiente o
anormale
1b che aumentano attività esistenti
1c che danno nuove funzioni/attività
Gruppo II
proteine terapeutiche con bersagli mirati
2a
che interferiscono con l’attività fisiopatologiche
2b
che rilasciano un composto
terapeutico in un distretto specifico
STRUTTURA DELLE IMMUNOGLOBULINE
Riconoscimento
antigene
Riconoscimento
antigene
Stabilità
Regione cerniera
Reclutamento di
funzioni effettrici
Frammento Fc
Legame al
recettore di
riciclo
Da Abbas, Lichtman & Pober: Cellular and Molecular Immunology. W.B. Saunders, 1999
LE IMMUNOGLOBULINE SONO NATURALMENTE
SUDDIVISE IN DOMINI FUNZIONALI
Da Abbas, Lichtman & Pober: Cellular and Molecular Immunology. W.B. Saunders, 1999
PRINCIPALI AVANZAMENTI BIOTECNOLOGICI CHE
HANNO CONSENTITO LO SVILUPPO DELLA
IMMUNOTERAPIA CON ANTICORPI
1975
George Kohler and Cesar Milstein (Nobel 1984) sviluppano
la tecnologia di
ibridazione
somatica
per
la
produzione di anticorpi monoclonali
Anticorpi Monoclonali MURINI in vivo:
PRINCIPALI VANTAGGI:
 OMOGENEITA’ DELLE PREPARAZIONI
 SEMPLICITA’ DI PREPARAZIONE
Murino
Chimerico
Umanizzato
Umano
Cellula ES
A
Inserimento dei geni
esogeni
IgH umana
Igk umana
Fusione sferoplasti
contenenti
cloni YAC
B
Inattivazione dei geni
endogeni
Linea trasgenica producente
anticorpi murini e umani
IgH murina
X
Igk murina
X
Linea trasgenica incapace di produrre
anticorpi murini
C
Linea trasgenica producente anticorpi umani
Rituximab
Il rituximab si lega a CD20, che si trova sulla superficie di uno
dei tipi principali di globuli bianchi normali (linfociti B). Questa
proteina si trova anche sulla superficie della maggior parte dei
linfociti B che causano alcune forme di linfoma non Hodgkin. Il
rituximab agisce attaccando sia i linfociti B maligni sia quelli
normali; tuttavia, l’organismo è in grado di sostituire
rapidamente eventuali globuli bianchi normali danneggiati,
riducendo in tal modo sensibilmente il rischio di effetti collaterali.
Quando l’anticorpo monoclonale riconosce la proteina, LA
LEGA e in questo modo stimola il sistema immunitario
dell’organismo ad aggredire le cellule neoplastiche e può anche
indurre le cellule a distruggere se stesse.
Rituximab: alcuni dati!!


Primo anticorpo per terapia oncologica


> 350.000 pazienti trattati
Il trattamento con rituximab da solo o
in combinazione con chemioterapia e’ in
grado di dare una significativa risposta
clinica (40% vs 10% ) ed un significativo
prolungamento di tempo alla ricaduta
(27 mesi vs 7 mesi)
>80 trial clinici in corso (www.clinical
trials.gov)
NOME GENERICO /
NOME COMMERCIALE
Trastuzumab
/Herceptin
TIPO DI
ANTICORPO
BERSAGLIO
APPROVAZIONE
FDA
Her2R
1998
VEGF
2004
EGFR
2004
Umanizzato
Bevacizumab
/Avastin
Chimerico
Cetuximab
/Erbitux
A
Targetting
Target
Effector
Transtuzumab
e Cetuximab
Fc Receptor
Ag
meccanismo d’azione
Blocco del segnale
MAb
di crescita
Ligands
blocked
by MAb
Target
B Blocking
HER2/EGFR
Signals blocked
by MAb
Altri meccanismi immunologici
Trastuzumab: alcuni dati!!

Primo anticorpo approvato per terapia
tumori solidi

Il trattamento con trastuzumab da solo
come prima linea nei tumori metastatici
ha dato 26% di risposta ed in
combinazione con chemioterapici da’ un
significativo prolungamento di tempo
medio di risposta

> 100.000 pazienti trattati
Nature Biotechnology, 2006
Herceptin (trastuzumab) the first protein kinase inhibitor to be
approved, back in 1998, remains by far the most effective kinase
inhibitor for treating any of the common cancers.
Gli anticorpi possono agire in vivo meglio di
piccole molecole di sintesi?
Trastuzumab
Il trastuzumab (Herceptin() è un anticorpo monoclonale ricombinante
umanizzato, con elevata affinità di legame per la proteina Her-2/neu e in
grado di inibirne gli effetti sulla trasformazione cellulare maligna a livello
dei tessuti epiteliali. HER-2/neu è una proteina di 185 kd, codificata
dal gene c-erbB2 appartenente alla famiglia dell'epidermal growth
factor receptor ad attività tirosin kinasica di tipo I.
Questo recettore, attraverso il legame con il ligando (Heregulin) e
processi di fosforilazione, stimola la proliferazione e il differenziamento
cellulare. HER-2/neu è espresso in molti tessuti normali ma è la
iperespressione di questo recettore, che consegue a meccanismi del
tipo amplificazione genica, ad avere un ruolo determinante nella
patogenesi molecolare di alcune neoplasie epiteliali e, in particolare, del
cancro mammario. L'iperespressione di HER-2/neu è stata rilevata in
circa il 30% dei pazienti con carcinoma mammario metastatico e
sembra costituire un fattore prognostico negativo
Umanizzato
Bevacizumab: alcuni dati!!

Il primo agente anti-angiogenico in grado
di prolungare la sopravvivenza

Il trattamento con bevacizumab da solo o
in combinazione con chemioterapia e’ in
grado di dare una significativa risposta
clinica in ca. renale (45% vs 35% ) e ca.
colon

>> trial clinici
trials.gov)
in
corso
(www.clinical
Studi in avanzato stato di sviluppo

Attualmente in corso negli USA con
anticorpi monoclonali 84 trial clinici
di fase III (www.clinical trials.gov)

35/84 sono per tumori solidi:
 3 transtuzumab + chemio
 13 bevacizumab + chemio
 14 cetuximab + chemio
 2 bevacizumab + cetuximab + chemio
 5 altri
Umano
Panitumomab: alcuni dati!!
 anticorpo anti EGFR da topo
trasgenico (IgG2)

Studio di fase III randomizzato in 443 pt
con ca. Colon metastatico in ripresa di
malattia: il trattamento con panitumomab in
combinazione con chemio vs chemio e’ in
grado di dare una significativo
prolungamento del tempo alla progressione
(49% vivi vs 30% dopo 32 settimane)

Le risposte correlano con la tossicità
cutanea

Si prevede l’approvazione FDA a breve
Ipilimumab: alcuni dati
Umano
 anticorpo anti CTLA-4 da topo
trasgenico (successivamente
ingegnerizzato a IgG4 per evitare
reclutamento C’ o FcR)

Studi di fase I/II nel melanoma e nel ca.
ovarico

Incidenza di autoimmunità (grado III-IV)
nel 15-25% dei casi

Meccanismo: modulazione dell’inibizione,
adiuvante in vaccinologia, altro (sviluppo di
anticorpi anti MICA)
AACR, April 2006:
TNF, tumor necrosis factor, produced by immuno
competent cells, binds to TNF receptors (TNFR)
and induces pro-inflammatory cytokine secretion
(the NFkB pathway can be involved), increased
cell migration to epidermis, activation of
keratinocytes
TNF alpha antagonists
Infliximab is a monoclonal antibody. It binds to
TNF, and inhibits binding of TNF to cell surface
TNF receptors
Etanercept is a fusion protein consisting of an
extracellular part of a TNFR linked to the Fc
portion of IgG1. Etanercept binds TNF & blocks
its interaction with cell surface TNF receptors
ANTAGONISTI DI TNFalfa
Mechanism of action of TNF-α antagonists. The monoclonal antibody
(infliximab, adalimumab) and the receptor analog (etanercept) bind to
circulating TNF-α and block its interaction with membrane receptor.
Abatacept ( Orencia ) è il capostipite di una nuova classe di farmaci
denominati modulatori selettivi della costimolazione delle cellule T.
Abatacept inibisce la funzione delle cellule T, ma non produce
deplezione di queste cellule.
Le cellule T attivate sono coinvolte nella cascata infiammatoria, con
conseguente infiammazione a livello delle articolazioni e danno
strutturale irreversibile. Abatacept è indicato nella riduzione dei segni e
dei sintomi dell’artrite reumatoide in forma moderato-grave nei pazienti
adulti, con inadeguata risposta ad almeno un farmaco modificante la
malattia ( DMARD ).
Abatacept: proteina di fusione tra il dominio extracellulare di
CTLA4 e la porzione Fc modificata dell’IG umana G1; inibisce le
cellule T legando CD80 e CD86 bloccandone la interazione con
CD28 e quindi bloccando la attivazione autoiimune delle cellule T
ENFUVIRTIVE: peptide di 36 aa
che blocca l’entrata del virus HIV
nella cellula ospite legando la
proteina di superficie del virus
gp120/gp41
Analoghi del GH : Pegvisomant
Analogo ricombinante di hGH
- lys 120 sostituita con una gly
previene la dimerizzazione funzionale del recettore
qualsiasi aminoacido tranne lys o ala in questa posizione:
Promotore della crescita Þ antagonista GH
- Pegilazione – coniugazione via i gruppi aminici a 4 - 6
catene di polietilen-glicole
Aumento di T1/2 (SC) a circa 6 giorni
Picco plasmatico 33 - 77 ore
Ridotta immunogenicità
la pegilazione maschera i determinanti antigenici
Ridotta affinità di legame
altri otto aminoacidi sostituiti
pegvisomant
Gruppo II
proteine terapeutiche con bersagli mirati
2a
che interferiscono con l’attività fisiopatologiche
2b
che rilasciano un composto
terapeutico in un distretto specifico
TOSITUMOMAB
lega l’antigene di superficie CD20 e stimola apoptosi;
puo’ essere accoppiato con Iodio radionmarcato per
svolgere una attività radiotossica