Isolamento di ceppi resistenti di Salmonella con fenotipo ESBL in

III Workshop nazionale di epidemiologia veterinaria – Abano Terme, 13-14 settembre 2007
Isolamento di ceppi resistenti di Salmonella
con fenotipo ESBL in allevamenti di polli da ingrasso
Staffolani Monica1, Valli M. Beatrice1, Striano Gianluca1 , Franco Alessia 2, Lovari Sarah2 e Fisichella S1.
1 Istituto Zooprofilattico Umbria Marche-Centro di Riferimento Regioanle per gli Enteropatogeni-Macerata
2 Istituto Zooprofilattico Lazio Toscana-Centro Nazionale di referenza per l’ Antibiotico Resistenza-Roma
INTRODUZIONE
L’Antibioticoresistenza è l'emergenza e la propagazione di fattori di resistenza
batterica agli antibiotici ed riconosce tra le cause la pressione selettiva esercitata
sulle popolazioni microbiche dall'uso di questi farmaci.
Negli ultimi decenni, a fronte di un utilizzo estensivo degli antibiotici in medicina
veterinaria, anche con molecole di classe o struttura analoghe a quelle usate in
medicina umana, si è assistito all’emergenza di fenomeni di antibioticoresistenza
in batteri patogeni animali, commensali ed agenti di zoonosi.
Attualmente, tra le classi di determinanti di resistenza di maggior impatto in
Sanità Pubblica Veterinaria vi sono le beta-lattamasi a spettro esteso (extendedspectum beta lactamases, ESBLs)
La rilevanza di tale classe di determinanti è data dal fatto che le beta lattamasi a
spettro esteso inattivano alcune molecole antibiotiche (e. g. cefalosporine di terza
generazione) di elezione nella terapia umana delle infezioni invasive e
setticemiche di agenti zoonosici come Salmonella spp. oppure opportunisti.
In ambito veterinario, tra i ceppi di Salmonella spp., il rinvenimento del fenotipo
ESBL non è frequente e la resistenza alle cefalosporine di terza generazione
risulta estremamente bassa sia a livello nazionale che europeo.
RISULTATI
Dei 9 ceppi di Salmonella resistenti o intermedi alle cefalopsorine ed inviati al
CRAB, 6 sono risultati caratterizzati dal fenotipo di resistenza ESBL, cinque
appartenenti al sierotipo S. Livingstone ed uno al sierotipo Salmonella 4,5,12:i:(tabella 2).
Gli isolati di S. Livingstone sono risultati positivi per il gene blaSHV, mentre l’isolato
di Salmonella 4,5,12:i:- è risultato positivo per il gene blaTEM e per la classe di
determinanti di resistenza blaAmpC, in particolare blaCMY-2.
I ceppi di S. Livingstone appartengono probabilmente allo stesso cluster e sono
stati isolati nel mese di febbraio 2005 in seguito agli accertamenti diagnostici volti
ad indagare le cause di un calo dell’indice di conversione in un allevamento
avicolo della provincia di Macerata, attribuito poi all’infezione concomitante da S.
Enteritidis. Tutti i ceppi hanno mostrato resistenza in vitro a 6 antibiotici
(Ampicillina, Streptomicina, Sulfonamidi, Acido Nalidixico, Gentamicina e
Cefotaxime).
Il ceppo di Salmonella 4,5,12:i:-, è stato isolato nel settembre 2006 nel corso
dello studio sulla prevalenza di Salmonella spp. in allevamenti di broiler (Reg CE
n° 2160/2003) dai campioni di sovrascarpe prelevati presso un allevamento della
provincia di Macerata ed è risultato resistente a 7 antibiotici (Ampicillina,
Streptomicina, Sulfonamidi, Tetraciclina, Amoxicillina-Acido Clavulanico,
Cefotaxime, Ceftazidime).
Tabella 2
n°
ceppo
sierotipo
anno
matrice
specie
animale
esito CTX
diffusione in
agar
esito CTX
MIC
geni ESBL
1
Thompson
2005
fegato
pollo
I
S
non eseguito
2
Livingstone
2005
tampone
ambientale
pollo
R
I
blaSHV
3
Livingstone
2005
tampone
ambientale
pollo
R
I
blaSHV
4
Livingstone
2005
tampone
ambientale
pollo
R
I
blaSHV
2005
tampone
ambientale
pollo
pollo
I
S
non eseguito
5
Livingstone
MATERIALI E METODI
Nell’ambito dell’attività istituzionale del Centro di Riferimento Regionale di
Macerata, in applicazione del sistema di sorveglianza per gli Enteropatogeni EnterVet, nel periodo tra il 2002 e il 2006 sono stati tipizzati sierologicamente e
caratterizzati per il profilo di antibioticoresistenza circa 720 ceppi di Salmonella di
origine animale, ambientale o alimentare.
Per la determinazione del sierotipo è stata seguita l’ultima edizione dello schema di
Kauffman White mediante l’utilizzo di sieri del commercio (Biogenetics)
Per la determinazione del sierotipo con formula antigenica 4,5,12:i:- è stato
impiegato un saggio di PCR messo a punto sulla base di un lavoro pubblicato da
autori spagnoli
Il pannello di antibiotici (Oxoid) impiegato è composto da 16 molecole come
riportato nella tabella 1.
La valutazione della sensibilità agli antibiotici (test di screening e conferma
fenotipica) è stata ottenuta mediante diffusione in agar secondo le raccomandazioni
del Clinical and Laboratory Standard Institute CLSI (ex NCCLS),
Tutti gli isolati di Salmonella che abbiano dato un esito resistente o intermedio alle
cefalosporine sono stati inviati al Centro di Referenza Nazionale per
l’Antibioticoresistenza (CRAB) dove sono stati confermati i test di sensibilià agli
antibiotici mediante metodo della Minima Concentrazione inibente. Tutti i ceppi che
hanno dato esito resistente o intermedio alla MIC sono stati sottoposto al test di
Conferma Fenotipico per ESBL così come indicato nel Documento CLSI (exNCCLS) M31-A2.
Gli isolati risultati positivi per il test di conferma sono stati poi analizzati tramite PCR
per la presenza dei geni blaSHV, blaTEM, blaCTX-M, blaOxa1, blaAmpC.
Tabella 1
sigla
antibiotico
concentrazione
NA
Acido nalidixico
30 mcg
AM
Ampicillina
10 mcg
CTX
Cefotaxime
30 mcg
CIP
Ciprofloxacina
5 mcg
C
Cloramfenicolo
30 mcg
GM
Gentamicina
10 mcg
K
Kanamicina
30 mcg
S
Streptomicina
10 mcg
S3
Sulfonamide
300 mcg
Te
Tetraciclina
30 mcg
ENR
Enrofloxacina
5 mcg
AMC
Amoxicillina + Acido Clavulanico
20 / 10 mcg
KF
Cefalotina
30 mcg
CAZ
Ceftazidime
30 mcg
CL
Colistina
10 mcg
SXT
Trimetoprim + Sulfametossazolo
1.25 / 23.75 mcg
CONCLUSIONI
R
I
blaSHV
6
Livingstone
2005
tampone
ambientale
7
Typhimurium
2005
fegato
pollo
I
S
non eseguito
8
Livingstone
2005
carne fresca
pollo
I
I
blaSHV
9
4,5,12:i:-
2006
feci
pollo
R
R
blaTEM
I risultati di questo lavoro sottolineano l’importanza dei test di sensibilità di
primo livello come strumento di screening primario per le resistenze
antibiotiche correlate al fenotipo ESBL. Inoltre si vuole mettere in evidenza
la necessità di aumentare l’attenzione in merito all’esito dei test di sensibilità.
Infatti per alcuni antibiotici appartenenti alle Cefalosporine di terza
generazione, anche esiti intermedi dovrebbero indurre ad un
approfondimento diagnostico in quanto possibili segnali di presenza del
fenotipo ESBL.
Il presente studio conferma l’importanza del ruolo svolto dai laboratori di
primo e secondo livello della rete degli II.ZZ.SS, strumenti essenziali per
fornire sensibilità e specificità adeguata al Sistema di Sorveglianza delle
antibioticoresistenze nel settore veterinario, che è parte integrante della
Sorveglianza che opera a favore delle azioni di Sanità Pubblica.
BIBLIOGRAFIA
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