Topi Min (Multiple intestinal neoplasia)

I giovedì della cultura scientifica
“Etica e sperimentazione animale nella ricerca biomedica”
Genomica e modelli animali
di malattie umane
Mariateresa Mancuso
BIOTEC-MED
Mus Musculus : organismo modello nella ricerca biomedica
Piccole dimensioni:
facile da manipolare,
Organismo
complesso
bassi costi di
mantenimento
Similarità
Alto tasso di fertilità:
fisiologica e
progenie multipla
genetica con l’uomo
ottenibile ogni 9
settimane
Confronto tra il genoma del topo e dell’uomo
 14% più piccolo (2.5 bilioni di basi versus 2.9)
 > 90% di sintenia
Topo
Cromosomi di topo
Uomo
Cromosomi umani
350 regioni conservate
 Entrambi contengono circa 30.000 geni codificanti proteine
 80% dei geni in omologia
Il genoma del topo è facilmente manipolabile
TOPI INBRED
Accoppiamento tra
fratello-sorella per 2030 generazioni successive
 98.6% di omozigosi
a tutti i loci
 Minima variabilità
genetica in una
popolazione
 Possibilità di fissare
uno specifico fenotipo
Suscettibilità o
resistenza
allo sviluppo di
tumori spontanei
La suscettibilità e/o la resistenza all’insorgenza di un particolare tumore può essere
ottenuta tramite un programma di accoppiamento selettivo bidirezionale mediante
applicazione di un protocollo di cancerogenesi chimica a due stadi
Selezione genetica delle linee Car-S e Car-R
D B A /2
A
F1
P
SWR
SJL
F 1
CB A
BA L B / c
F 1
F 2
C 57 B L/ 6
F 1
F 2
F0
C a r -S
DMBA-TPA
-
DMBA-TPA
-
Basse dosi
Alte dosi
( F1 9 )
Differenza in termini di suscettibilità
> di 100 volte
C a r-R
( F1 6 )
Alcuni geni coinvolti nella suscettibilità e nella resistenza sono stati identificati
…primi tentativi di manipolazione genetica del genoma murino
Mutazioni multiple casuali introdotte nella linea germinale
mediante l’utilizzo di cancerogeni chimici permettono di identificare singole
mutazioni responsabili dell’insorgenza di un determinato fenotipo
Topi Min (Multiple intestinal neoplasia)
C57Bl/6
C57Bl/6
Ottenuti mediante
mediante mutagenesi
mutagenesi
Ottenuti
germinale con
con ENU
ENU
germinale
Adenocarcinomi intestinali
intestinali
Adenocarcinomi
Fenotipo primario
primario trasmesso
trasmesso
Fenotipo
alla progenie
progenie
alla
Poliposi adenomatosa
adenomatosa
Poliposi
familiare
familiare
Mutazione
Mutazione Min
Min
Mutazione eterozigote
eterozigote del
del
Mutazione
gene APC
APC (oncosoppressore)
(oncosoppressore)
gene
Ch18.
Ch18. Mutazione
Mutazione non-senso
non-senso
nel
nel codone
codone 850
850 del
del gene
gene murino
murino Apc
Apc
Primo modello animale utilizzato per studi quantitativi e meccanicistici
dell’induzione di neoplasie intestinali
 Impossibilità di controllare i geni bersaglio da modificare
 Necessità di vasti programmi di allevamento
 Difficoltà di identificare i fenotipi recessivi
Lo sviluppo delle nuove metodologie per
manipolare il genoma murino
ha rivoluzionato la capacità di generare
modelli animali di malattie umane
Animali geneticamente
modificati
Transgenici
Knockout
patologie dovute ad
alterazione di funzione
patologie dovute ad
assenza di funzione
TOPI TRANSGENICI
Promotore
Patologie dovute ad alterazione di funzione
ATG Gene/cDNA di interesse
Microiniezione
P(A)
Femmina balia
TOPI FONDATORI
Analisi del DNA
In grado di trasmettere il
carattere per via ereditaria
Possono differire per numero di copie inserite (2-50)
Effetto posizionale
Alterazione dell’espressione di un gene endogeno
Il modello che meglio rappresenta la malattia umana deve essere selezionato
osservando la progenie di vari topi fondatori
TOPI KNOCKOUT
Patologie dovute ad assenza di funzione
Ricombinazione
Elettropolazione
Costrutto
Neo
Cellule ES
Cellula ES con
un gene
mutato
Selezione delle
cellule KO
mediante
trattamento con
la neomicina
Microiniezione
Knockout omozigote
(-/-)
Chimera
Knockout
eterozigote
(+/-)
L’assenza di funzione di un gene è spesso
incompatibile con la vita
Impianto in
una femmina
balia
La speranza è che il topo mutante esibisca sintomi
simili ai soggetti umani e che la
patogenesi sia simile in entrambe le specie
 Studiare gli stadi precoci prima della comparsa dei sintomi
 Possibilità di individuare in vivo i bersagli di farmaci in via
di sperimentazione
Sono centinaia i modelli animali di malattie umane a carattere
monogenico attualmente disponibili
Malattie metaboliche e ormonali
Fibrosi cistica
Ipercolesterolemia familiare
Arteriosclerosi
K
K,T
K
Cftr
Ldlr
Fmr1
Malattie immunologiche ed ematologiche
Emofilia A
Talessemia a
Talessemia b
K
K
K
C/8
Hba
Hbb
Malattie della vista e dell’udito
Retinite pigmentosa
Degenerazioni della retina
T
T
Rho
Prph2
Disfunzioni della cresta neurale
Albinismo oculocutaneo
Sindrome di Waardenburg
T
K
Tyr
Mitf
Malattie neurologiche e neuromuscolari
Morbo di Alzheimer
Ataxia telangiectasia
Sindrome X fragile
K,T
K
K
App
Atm
Fmr1
Sindromi familiari di predisposizione al tumore
Retinoblastoma familiare
Poliposi adenomatasa del colon
Sindrome di Li-fraumeni
Sindrome di Gorlin
K
K
K
K
Rb
Apc
p53
Ptch
mi
SINDROME DI GORLIN
Numerose anomalie nello sviluppo
Ritardo mentale
Crescita eccessiva del corpo
Predisposizione alla tumorigenesi
spontanea e radioindotta
Ptch1
Ptch1
-/+/-
letale
fenocopia della
sindrome di Gorlin
Malattia ereditaria autosomica dominante con una
incidenza stimata pari a 1/50.000-150.000.
Difetto costituzionale in una delle due copie di un
gene soppressore tumorale (Patched1)
Medulloblastoma (10%)
Sarcomi
Fibromi ovarici
Basalioma (dopo irraggiamento)
BASALIOMA
RI
MEDULLOBLASTOMA
 Identificazione e caratterizzazione
molecolare delle lesioni preneoplastiche
 Dipendenza dall’età al momento
dell’irraggiamento
 Possibilità di identificare la cellula
bersaglio
 Sperimentare terapie farmacologiche
e geniche
TOPI KNOCKOUT CONDIZIONALI: il sistema Cre/lox P
Questa strategia viene utilizzata per produrre modelli knockout
condizionali in cui è possibile accendere o spegnere l’espressione di un
gene in un determinato tipo cellulare.
Estremamente vantaggiosa quando sono coinvolti geni la cui mutazione
risulterebbe letale.
Cre è una ricombinasi sito-specifica che
riconosce la sequenza lox P del fago P1.
Quando due siti lox P vengono inseriti nel DNA,
la proteina Cre promuove la rimozione del
frammento di DNA compreso tra i lox P.
Incrociando un topo che porta il gene di interesse,
fiancheggiato da due sequenze lox P, con uno in cui il
gene Cre si trova sotto il controllo di un promotore
tessuto-specifico, si ottiene un organismo in cui il gene
verrà rimosso solo nelle cellule che esprimono Cre.
MUTANTI CONDIZIONALI PER LO STUDIO DEL TUMORE MAMMARIO
Nel 50% dei casi di tumore mammario familiare sono state riscontrate mutazioni del gene Brca1.
La mancanza di Brca1 causa una
precoce mortalità embrionale
Mutante condizionale in cui si determina la
rimozione dell’esone 11 di Brca1 solo nelle
cellule epiteliali del tessuto mammario
Tumore mammario
Bassa frequenza
Lunga latenza
Quali altri geni sono coinvolti nello sviluppo del tumore mammario ?
Mutanti condizionali per Brca1 e p53
+/-
: il 73% sviluppa il tumore
La perdita di p53 accelera lo sviluppo tumorale delle ghiandole
mammarie di topi che presentano una specifica delezione di Brca1
CONCLUSIONI
 Ci permettono di studiare la malattia in numerosi individui con un background
omogeneo.
 La progressione della malattia può essere seguita in ambiente altamente
controllato
 Anche quando il modello animale non ricapitola pienamente la malattia
umana, può comunque fornire importanti indicazioni delle differenze
interspecifiche e della suscettibilità individuale
 Disporre di un modello animale premette di testare l’azione di nuovi
farmaci e pone le basi per una possibile terapia genica
Malattie a carattere poligenico: obiettivo primario nel
futuro della ricerca biomedica
Come fareste
senza di me?