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Diapositiva 1 - ENEA (Bologna)
I giovedì della cultura scientifica “Etica e sperimentazione animale nella ricerca biomedica” Genomica e modelli animali di malattie umane Mariateresa Mancuso BIOTEC-MED Mus Musculus : organismo modello nella ricerca biomedica Piccole dimensioni: facile da manipolare, Organismo complesso bassi costi di mantenimento Similarità Alto tasso di fertilità: fisiologica e progenie multipla genetica con l’uomo ottenibile ogni 9 settimane Confronto tra il genoma del topo e dell’uomo 14% più piccolo (2.5 bilioni di basi versus 2.9) > 90% di sintenia Topo Cromosomi di topo Uomo umani Cromosomi 350 regioni conservate Entrambi contengono circa 30.000 geni codificanti proteine 80% dei geni in omologia Il genoma del topo è facilmente manipolabile TOPI INBRED Accoppiamento tra fratello-sorella per 2030 generazioni successive 98.6% di omozigosi a tutti i loci Minima variabilità genetica in una popolazione Possibilità di fissare uno specifico fenotipo Suscettibilità o resistenza allo sviluppo di tumori spontanei La suscettibilità e/o la resistenza all’insorgenza di un particolare tumore può essere ottenuta tramite un programma di accoppiamento selettivo bidirezionale mediante applicazione di un protocollo di cancerogenesi chimica a due stadi Selezione genetica delle linee Car-S e Car-R D B A /2 A F1 P SWR SJL F 1 CB A BA L B / c F 1 F 2 C57 BL/ 6 F 1 F 2 F0 C a r -S DMBA-TPA - DMBA-TPA - Basse dosi Alte dosi ( F1 9 ) Differenza in termini di suscettibilità > di 100 volte C a r-R ( F1 6 ) Alcuni geni coinvolti nella suscettibilità e nella resistenza sono stati identificati …primi tentativi di manipolazione genetica del genoma murino Mutazioni multiple casuali introdotte nella linea germinale mediante l’utilizzo di cancerogeni chimici permettono di identificare singole mutazioni responsabili dell’insorgenza di un determinato fenotipo Topi Min (Multiple intestinal neoplasia) C57Bl/6 C57Bl/6 Ottenuti mediante mediante mutagenesi mutagenesi Ottenuti germinale con con ENU ENU germinale Adenocarcinomi intestinali intestinali Adenocarcinomi Fenotipo primario primario trasmesso trasmesso Fenotipo alla progenie progenie alla Poliposi adenomatosa adenomatosa Poliposi familiare familiare Mutazione Mutazione Min Min Mutazione eterozigote eterozigote del del Mutazione gene APC APC (oncosoppressore) (oncosoppressore) gene Ch18. Ch18. Mutazione Mutazione non-senso non-senso nel nel codone codone 850 850 del del gene gene murino murino Apc Apc Primo modello animale utilizzato per studi quantitativi e meccanicistici dell’induzione di neoplasie intestinali Impossibilità di controllare i geni bersaglio da modificare Necessità di vasti programmi di allevamento Difficoltà di identificare i fenotipi recessivi Lo sviluppo delle nuove metodologie per manipolare il genoma murino ha rivoluzionato la capacità di generare modelli animali di malattie umane Animali geneticamente modificati Transgenici Knockout patologie dovute ad alterazione di funzione patologie dovute ad assenza di funzione TOPI TRANSGENICI Promotore Patologie dovute ad alterazione di funzione ATG Gene/cDNA di interesse Microiniezione P(A) Femmina balia TOPI FONDATORI Analisi del DNA In grado di trasmettere il carattere per via ereditaria Possono differire per numero di copie inserite (2-50) Effetto posizionale Alterazione dell’espressione di un gene endogeno Il modello che meglio rappresenta la malattia umana deve essere selezionato osservando la progenie di vari topi fondatori TOPI KNOCKOUT Patologie dovute ad assenza di funzione Ricombinazione Elettropolazione Costrutto Neo Cellule ES Cellula ES con un gene mutato Selezione delle cellule KO mediante trattamento con la neomicina Microiniezione Knockout omozigote (-/-) Chimera Knockout eterozigote (+/-) L’assenza di funzione di un gene è spesso incompatibile con la vita Impianto in una femmina balia La speranza è che il topo mutante esibisca sintomi simili ai soggetti umani e che la patogenesi sia simile in entrambe le specie Studiare gli stadi precoci prima della comparsa dei sintomi Possibilità di individuare in vivo i bersagli di farmaci in via di sperimentazione Sono centinaia i modelli animali di malattie umane a carattere monogenico attualmente disponibili Malattie metaboliche e ormonali Fibrosi cistica Ipercolesterolemia familiare Arteriosclerosi K K,T K Cftr Ldlr Fmr1 Malattie immunologiche ed ematologiche Emofilia A Talessemia α Talessemia β K K K C/8 Hba Hbb Malattie della vista e dell’udito Retinite pigmentosa Degenerazioni della retina T T Rho Prph2 Disfunzioni della cresta neurale Albinismo oculocutaneo Sindrome di Waardenburg T K Tyr Mitf Malattie neurologiche e neuromuscolari Morbo di Alzheimer Ataxia telangiectasia Sindrome X fragile K,T K K App Atm Fmr1 Sindromi familiari di predisposizione al tumore Retinoblastoma familiare Poliposi adenomatasa del colon Sindrome di Li-fraumeni Sindrome di Gorlin K K K K Rb Apc p53 Ptch mi SINDROME DI GORLIN Numerose anomalie nello sviluppo Ritardo mentale Crescita eccessiva del corpo Predisposizione alla tumorigenesi spontanea e radioindotta Ptch1 Ptch1 -/+/- letale fenocopia della sindrome di Gorlin Malattia ereditaria autosomica dominante con una incidenza stimata pari a 1/50.000-150.000. Difetto costituzionale in una delle due copie di un gene soppressore tumorale (Patched1) Medulloblastoma (10%) Sarcomi Fibromi ovarici Basalioma (dopo irraggiamento) BASALIOMA RI MEDULLOBLASTOMA Identificazione e caratterizzazione molecolare delle lesioni preneoplastiche Dipendenza dall’età al momento dell’irraggiamento Possibilità di identificare la cellula bersaglio Sperimentare terapie farmacologiche e geniche TOPI KNOCKOUT CONDIZIONALI: il sistema Cre/lox P Questa strategia viene utilizzata per produrre modelli knockout condizionali in cui è possibile accendere o spegnere l’espressione di un gene in un determinato tipo cellulare. Estremamente vantaggiosa quando sono coinvolti geni la cui mutazione risulterebbe letale. Cre è una ricombinasi sito-specifica che riconosce la sequenza lox P del fago P1. Quando due siti lox P vengono inseriti nel DNA, la proteina Cre promuove la rimozione del frammento di DNA compreso tra i lox P. Incrociando un topo che porta il gene di interesse, fiancheggiato da due sequenze lox P, con uno in cui il gene Cre si trova sotto il controllo di un promotore tessuto-specifico, si ottiene un organismo in cui il gene verrà rimosso solo nelle cellule che esprimono Cre. MUTANTI CONDIZIONALI PER LO STUDIO DEL TUMORE MAMMARIO Nel 50% dei casi di tumore mammario familiare sono state riscontrate mutazioni del gene Brca1. La mancanza di Brca1 causa una precoce mortalità embrionale Mutante condizionale in cui si determina la rimozione dell’esone 11 di Brca1 solo nelle cellule epiteliali del tessuto mammario Tumore mammario Bassa frequenza Lunga latenza Quali altri geni sono coinvolti nello sviluppo del tumore mammario ? Mutanti condizionali per Brca1 e p53 +/- : il 73% sviluppa il tumore La perdita di p53 accelera lo sviluppo tumorale delle ghiandole mammarie di topi che presentano una specifica delezione di Brca1 CONCLUSIONI Ci permettono di studiare la malattia in numerosi individui con un background omogeneo. La progressione della malattia può essere seguita in ambiente altamente controllato Anche quando il modello animale non ricapitola pienamente la malattia umana, può comunque fornire importanti indicazioni delle differenze interspecifiche e della suscettibilità individuale Disporre di un modello animale premette di testare l’azione di nuovi farmaci e pone le basi per una possibile terapia genica Malattie a carattere poligenico: obiettivo primario nel futuro della ricerca biomedica Come fareste senza di me?