Slide 1 - Dipartimento di Farmacia

ANTICORPI MONOCLONALI
Adapted from Milstein (1980) Scientific American, Oct. p.58
Antigen
31 2 4
1
2
BA
LB /
c
Immunization
3
m
4
m
B cell
1
2
3
31 2 4
Antiseum
A mixture of all Ab
m
2 3
4
1
2
Spleen cells
+
Myeloma
1
4
x
m
3
Cell fusion
4
Monoclonal
antibodies
Pure single Ab
If a single
Each
B cellB produces
cell was picked
only one
up kind
and of
cultured,
antibody,
then
which
it willbinds
produce
to itsonly
specific
one kind
antigen.
of antibody.
After
Myeloma
IfEach
B cell
immunization,
hybridoma
is cell
fused
canwith
line
bethe
can
myeloma,
cultured
mouse
produce
inspleen
the
thepure
fused
testcontains
single
tube,
cell might
antibody,
but
B cells
can
benot
producing
cultured
called
produce
monoclonal
and
specific
useful
produce
antibody.
antibodies.
antibody.
antibody.
Conventional
But
B cell canantiserum
not surviveiswell
the mixture
in the culture.
of all antibodies produced by B cells from spleen.
Antibodies
Polyclonal
Antibodies that are collected
from sera of exposed animal
recognize
multiple antigenic sites
of injected biochemical.
Monoclonal
Individual B lymphocyte hybridoma
is cloned and cultured.
Secreted antibodies are collected
from culture media
recognize
ONE antigenic site
of injected biochemical
Hybridoma
1975 Kohler and Milstein
Multiple myeloma (human disease)
Fusions generated
by Sendai virus
or PEG
Bence Jones proteins in urine
http://www.immunecentral.com/images/immune_series/immune29.gif
Creation of monoclonal antibodies
(mAb’s)
1. Hyperimmunize mouse with Ag
2. Fuse B cells with tumor fusion partner (+ PEG)
3. Limiting dilution (96 wells)
to fractionate fused cells
in HAT media selection
HAT media (hypoxanthine, aminopterin, thymidine).
B cells die (mortal, HGPRT-positive)
Tumor cells die (HGPRT deficient and cannot utilise salvage pathway)
Fusions live (HAT Resistant and immortal)
Hybridoma selection (HAT media)
The de novo pathway can be inhibited using
aminopterin,
which inhibits the transfer of methyl groups
from activated dihydrofolic acid.
cells need Hypoxanthine and Thymine
as sources of purines and pyrimidines
for the salvage pathway.
Myeloma cells are HGPRT- and cannot create nucleotides in the salvage pathway.
Plasma cells are HGPRT+ and can utilize hypoxanthine in the salvage pathway.
Expand in mice or expand in vitro
in vitro material is
less concentrated
and contains
bovine serum
ascites fluid
contain high [mAb]
and minor
contamination
with mouse Ig
How to purify
your MAb
Affinity Purification
•
Or use Ag or epitope
to make
affinity column
Monospecific
antibodies
http://www.tulane.edu/~wiser/methods/handouts/pwpt/17_mab.pdf
IMPIEGHI DEGLI ANTICORPI
MONOCLONALI
• Protein purification
• Identification and isolation of cell subpopulations using fluorescence cell sorting.
• Tumor detection and imaging
• Tumor killing
• Diagnostic reagents.
• Drug Detoxification
• Catalytic antibodies
IMMUNODIFFUSIONE
Immunoprecipitation
• At appropriate ratio of antigen:antibody,
complex forms an insoluble aggregate.
• Technique can be used to purify specific
protein from a mixture
• Co-immunoprecipitation
– interacting proteins also
found in the
immunoprecipitate
Impieghi dell’immunoprecipitazione
• Determinazione delle concentrazioni
relative di anticorpi o di antigeni
• Confrontare diversi antigeni tra loro
• Stabilire la purezza di un preparato
antigenico
Immunodiffusione
• Quando l'immunoprecipitazione avviene
all'interno di un gel si parla più
propriamente di immunodiffusione.
• Immunodiffusione radiale
• Immunodiffusione doppia
• immunoelettroforesi
Diagrammi di possibili
Modelli di precipitazione
con la doppia immunodiffusione eseguita su un
antisiero e 2 diversi
preparati antigenici
A: epitopi identici
B:nessun epitopo in
comune
C:identità parziale
IMMUNOELETTROFORESI
Separazione elettroforetica degli Ag
Archi di precipitazione
• Determinare se un paziente produce
quantità troppo basse di Ab isotipi, come si
verifica in alcune immunodeficienze
• Si può vedere se produce se produce un
eccesso di alcune proteine, quali
albumina, immunoglobuline
Immunoelettroforesi quantitativa
Ponendo in grafico l’altezza degli archi contro la concentrazione
Si otterrà una retta di taratura che può servire per determinare
la concentrazione di Ag in un campione incognito
TEST DI GRAVIDANZA: ES. DI INIBIZIONE DI AGGLUTINAZIONE
(Presenza o assenza di gonadotropina)
IMMUNOFLUORESCENZA
Gli Ab sono marcati con molecole fluorescenti
• Le molecole fluorescenti assorbono luce a una
determinata lunghezza d’onda (eccitazione)e la
emettono ad un’altra lunghezza d’onda
(emissione).
• Se gli Ab sono marcati con i fluorocromi,
possono essere rilevati attraverso la valutazione
della luce colorata emessa in seguito
all’eccitazione a una determinata lunghezza
d’onda
• La luce emessa può essere rivelata con un
microscopio a fluorescenza
• I coloranti possono essere coniugati alla regione
Fc di una molecola senza modificarne la
specificità
• Coloranti: fluoresceina, rodamina, ficoeritrina
Immunofluorescense
IFA of Ehrlichia chaffeensis
in DH82 cells, 400X
Bullous pemphgoid with linear deposits
of IgG at dermal-epidermal junction
Very good rapid diagnostics
Citofluorimetria e fluorescenza
• Queste tecniche si basano sull’impiego di Ab fluorescenti a hanno
carattere qualitativo
• FACS (fluorescence-activated cell sorter)
• Quando una cellula passa davanti al raggio laser, la luce viene
deviata dal rilevatore e questa interruzione del segnale laser viene
registrata. Le cellule che possiedono l’Ab fluorescente legato ai loro
Ag di membrana vengono eccitate dal laser ed emettono luce, che
viene registrato da un secondo sistema, localizzato ad angolo retto
rispetto al raggio laser.
• Lo strumento conta ogni cellule quando passa davanti al raggio
laser e registra i livelli di fluorescenza emessa dalla cellula
• Un computer collegato crea i diagrammi con il numero delle cellule
in ordinata e la loro intensità di fluorescenza in ascissa
SEPARAZIONE DI CELLULE MARCATE CON Ab
DIAGNOSTICA
ELISA – Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
Test antigen
Test antiserum
Visualization of reaction
ELISA to test MAb production itself
The dark blue spot represents a positive clone.
The light blue spots are positive controls,
the next two wells to the right are negative controls
www.ch.tum.de/wasser/weller/ formerprojects_im...
SAGGIO
ELISPOT
Saggio radio-immunologico
•
Il metodo è basato sulla competizione tra un antigene non marcato e una quantità fissa
dello stesso antigene marcato, per il legame con un numero limitante e costante di siti
anticorpali.
– Ab + Ag*
– Ab/Ag* + Ag
•
Ab/Ag*
Ab/Ag Ab/Ag*
E' necessario costruire prima di tutto una curva di taratura,
% conc. Ag
Marcato legato a Ab
Tratto lineare
Conc. Ag non marcato
FRAZIONI DI Ab
The Fab fragment contains the
antigen binding site
Could be cleaved out by papain digest;
pepsin digestion even better, as it produces F(ab’)2
Often it is enough
for diagnostic purposes –
and it is easier to produce
Anti Botulinum toxin
Hinge
region
Equine FAB fragment product
made by DoD at time of Gulf War,
anti-ABCDEFG
www-structure.llnl.gov/ fab/fab_tutl.htm
Single chain Fv fragments
The size and specificity
of the ScFv fragment
may allow for attachment
to cryptic sites
http://www.gene-therapeutics.com/Service/custom%20scFv%20antibodies/Abb-scFv.gif
IMPIEGHI COME FARMACI
About 25-30% of women who have metastatic breast cancer
overexpress HER-2 (EGF) receptor
Determination of HER2-protein overexpression
(semiquantitative DAKO Hercep Test™)
Fluorescence in situ hybridisation (FISH)
of HER2 amplification
www.roche.com/pages/ facets/9/herc.htm
Herceptin (TrastuzuMAb)
anti-HER MAbs
Approved!
http://www.roche.com/pages/facets/9/herc1.jpg
Problemi con la terapia basata su
mAb
• Gli Ab di topo sono visti come estranei dal
sistema immunitario umano
• Innesco della risposta immunitaria contro
gli HAMA (human anti-mouse antibody)
• Danni nell’ospite
• mAb causerebbero meno problemi
• (volontari cercasi??!!)
• Soluzione: anticorpi ibridi uomo-topo
• Anticorpi chimerici: Combinazione della
regione variabile di topo con la regione
costante di uomo
• Anticorpi umanizzati: Ab combina solo gli
aa della regione ipervariabile di topo con il
resto di Ab umano
Anticorpi umanizzati
Clone those genes
and express them
as a recombinant protein
in the protein expression system
Sales of Rituxan/
MabThera by Year
http://www.sh.lsuhsc.edu/
intragrad/micro/micro297/4
Topi transgenici con segmenti genici di anticorpi umani
Xenomouse
(topo con IgH e Igk umani)
Abgenix
http://www.sh.lsuhsc.edu/
intragrad/micro/micro297/4
Immunotoxin: Antibody-Toxin
Conjugate
Antibody
is tumor-specific
ricin from the castor bean
(Ricinus communis).
waynesword.palomar.edu/ images/antibod2.gif
Only the targeted tumor cells are killed
by the toxin
Common side effect –
Vascular leak syndrome.
Could be relieved
by usage of mutated toxin
Bunch of other toxins
could be used
Saponin (from soapwort)
potent
single chain
ribosome
inactivating
protein
Goal:
treatment of
leukemias
and lymphomas
For T-cell leukemia could be
targeted via CD7
: www.som.soton.ac.uk/.../members/ DFlavell/djf2.htm
Monoclonal antibodies, which are specific for a certain antigen,
i.e. prostate carcinoma cells, can be tagged with a radioactive tracer,
which when injected into the body
will localize in areas of these recurrent carcinoma cells
www.stjosephs-marshfield.org/
OctreoScan in a patient
with metastatic small cell carcinoma of the prostate