antigen

Laboratorio di tecnologie abilitanti
Modulo LTA Immunologiche
• Colture di cells in sospensione e in adesione
• Produzione di anticorpi monoclonali
• Reazione linfocitaria mista (MLR)
Matteo Urbano
Anno accademico
2014/2015
Due linee di difesa
I. adattativa
I linfociti sono responsabili delle risposte immunitarie adattative
Lymphocyte Activation
T cells and B cells are morphologically
identical in the unstimulated or resting
state.
Upon stimulation by antigen, they
become “activated” and begin to
differentiate.
Activated B cells become plasma cells.
Activated T cells can become helper T
cells or cytotoxic T cells.
T and B Cell Activation
Specific Immunity
Teoria della selezione clonale
Ogni organismo produce, soprattutto durante i primi
anni di vita, un'enorme varietà di linfociti diversi in
piccole quantità (cloni): solo quelli che vengono in
contatto con antigeni specifici possono proliferare.
Le cellule B:
la produzione di anticorpi monoclonali
B cells Clonal Selection
• B-lymphocyte binds
antigen
• Stimulates
reproduction of B-cells
• B-cell differentiates
into memory cells and
plasma cells
–Plasma cells
produce soluble
antibody
–Memory cells
display antibody on
surface
Immunoglobulin Structure
• Heavy & Light
Chains
• Disulfide bonds
– Inter-chain
– Intra-chain
Disulfide bond
Carbohydrate
CL
VL
CH2
CH1
VH
Hinge Region
CH3
Immunoglobulin Fragments:
Structure/Function Relationships
Ag Binding
Complement Binding Site
Binding to Fc
Receptors
Classes of Antibodies
Five classes of antibodies (IgM, IgD,
IgG, IgA, and IgE) can be distinguished
by differences in the heavy chain
Differences in the heavy chains (the tail
regions) impart distinctive functional
properties to the classes of antibodies
Organizzazione strutturale dei
principali isotipi delle Ig umane
Antibody Production
The antigen receptor (B-Cell Receptor, BCR)
of a membrane bound antibody molecule is
presented on the surface of a resting B cell.
Upon activation, B cells proliferate and
produce millions of copies of a secreted
antibody with the same antigen binding sites.
La produzione degli anticorpi può avvenire nei
confronti di:
antigeni timo dipendenti, Ag TD,
antigeni proteici, componenti
virali, complessi aptene-carrier
antigeni timo indipendenti, Ag TI,
antigeni polivalenti con epitopi
ripetuti (proprietà tipiche dei polisaccaridi batterici, polimeri proteici,
lipopolisaccaridi, glicolipidi, acidi nucleici).
Per gli Ag TD la produzione degli anticorpi richiede l’attivazione delle
cells B da parte dei LT helper (CD4+, TH2). L’Ag viene ingerito da un
fagocita (DC, MO) presentato alla cellula T helper che attiva la cell B
causandone la trasformazione in plasmacellula.
Antigenic Determinants (Epitopes)
 The specific site of an antigen that binds to an
antibody is called an antigenic determinant or
epitope.
 Most antigens have a variety of epitopes that
generate a number of different antibodies that are
called polyclonal.
 A single idiotype of antibody to an antigen is termed
monoclonal.
Polyclonal antiserum vs. monoclonal antibodies
Immunizzazione
Induzione deliberata di una risposta
immunitaria
IMMUNOGENO: qualsiasi sostanza in grado di
scatenare una risposta immunitaria
ANTIGENE: qualsiasi sostanza che può legare
uno specifico anticorpo (proteine, carboidrati,
acidi nucleici, molecole organiche)
Per ottenere una risposta immunitaria forte nei confronti di
antigeni proteici è fondamentale che l’antigene sia iniettato
insieme ad un adiuvante
1) Gli adiuvanti convertono gli antigeni proteici solubili in
materiale particolato (più immunogenico)
2) Gli adiuvanti consentono un rilascio lento/prolungato
dell’antigene
3) La maggior parte degli adiuvanti contiene componenti
microbici che incrementano l’immunogenicità della
preparazione,
Induzione di una potente risposta
infiammatoria
Adiuvante: qualsiasi sostanza che incrementa l’immunogenicità
delle sostanze ad essa mescolate
Immunizzazioni ripetute:
1) Prima in CFA;
successsive in IFA
2) Aumento titolo anticorpi
3) Aumento affinità
(ipermutazione somatica)
4) Switch di classe
Una risposta immunitaria anticorpale, che includa la
generazione di memoria immunologica, può essere
indotta da parte di antigeni non peptidici, solo quando
questi vengono legati covalentemente a una proteina
carrier
Aptene-Carrier (proteina)
Carrier:
BSA (Bovine Serum Albumin)
KLH (Keyhole Lympet Hemocyanin)
tossoide tetanico
Aptene:
Allergeni,
polisaccaride batterico (Hemophilus
influenzae B – TD)
Aptene: antigene incompleto, capace di indurre la
formazione di anticorpi specifici solo se coniugato con una
proteina. Gli apteni sono sostanze a basso peso molecolare,
molto diffusi nell’ambiente esterno, che possono unirsi a
proteine dell’organismo con cui vengono a contatto
trasformandosi in antigeni completi verso i quali
l’organismo produrrà anticorpi.Questo fenomeno è alla base
di molte reazioni allergiche: asma, orticaria ecc.
Utilizzazione. Il complesso aptene-carrier, inoculato in
animale, determina la produzione di anticorpi diretti sia
contro il complesso sia contro il carrier, ma soprattutto
contro l’aptene stesso. Questo meccanismo è ampiamente
sfruttato per produrre anticorpi capaci di consentire, una
volta purificati, il loro uso in test immunometrici per il
dosaggio di piccole molecole come farmaci, droghe e
ormoni.
In 1975, Kohler and Milstein first
fused lymphocytes to produce a cell line
which was both immortal and a producer
of specific antibodies. The two scientists
were awarded the Nobel Prize for
Medicine in 1984 for the development of
this "hybridoma." The value of
hybridomas to the field was not truly
appreciated until about 1987, when MAbs
were regularly produced in rodents for
diagnostics.
Monoclonal Antibodies
Selection and Production
 Activated B cells contain a mixture of antibodies
directed against different epitopes.
 Activated B cells have a limited lifetime when grown in
culture.
 How can we select a single B cell clone (monoclonal)
and propagate the cell line?
Hybridomas
B lymphocytes can mutate into tumor cells that
result in a type of cancer termed myeloma.
Myeloma cells become “immortal” and will grow
indefinitely in culture.
Fusion of a single activated B cell and a
myeloma cell will create a hybridoma that can
grow indefinitely in culture.
Monoclonal Antibodies The Mouse System
Antibodies can be raised in mice by injection of
an antigen.
Repeated injections create a pool of activated B
cells.
Removal of the spleen and fusion with myeloma
cells creates a pool of hybridomas.
Dilution and culture creates many monoclonal cell
lines.
Myeloma cells, mutant
Caratteristiche:
• no Ab production
• HGPRT
-
Ipoxantina Guanina FosfoRibosil Transferasi
• TK-
Selezione degli ibridomi
E’ necessario creare condizioni di coltura in cui solo gli
ibridomi siano capaci di sintetizzare il DNA
Sistema HAT (ipoxantina-aminopterina-timidina)
La sintesi di DNA è condizionata alla presenza di NTP
sintetizzati a partire dai rispettivi monofosfati
Gli NTP si formano da:
a- sintesi De novo (via normale)
b - via di salvataggio (via alternativa)
HAT
H = ipoxantina
L’ipoxantina è usata come sorgente esogena di purine, è fosforilata
dall’enzima Ipoxantina Guanina FosfoRibosil Transferasi (HGPRT) a
formare IMP che, alternativamente, può essere convertito a AMP e
GMP
A= aminopterina
L’aminopterina blocca tutte le reazione dell’enzima diidrofosfato
reduttasi (DHPR) che è coinvolto nella sintesi de novo di AMP e GMP e
anche nella metilazione di UMP a formare dTMP. Di conseguenza, la
cellula diventa completamente dipendente dalla via di salvataggio per
produrre i trifosfati purinici e pirimidinici per la sintesi del DNA
T = timidina
La timidina usata come sorgente esogena, è fosforilata dalla timidina
chinasi (TK) per formare TMP.
Impiego degli anticorpi monoclonali
Immunofluorescience
Cellule T:
Il rigetto dei trapianti
Tipi di trapianto
Autologo, trapianto da un individuo allo stesso individuo (cambio solo di sede);
Singenico, tra due individui geneticamente identici (gemelli identici – monozigoti);
Allogenico, tra due individui della stessa specie ma geneticamente differenti
MHCa
MHC restriction delle cellule T
(Zinkernagel & Doherty 1974)
Il ruolo principale delle molecole MHC è di
iniziare una risposta immunitaria presentando
peptidi antigenici sulla superficie delle cellule
che possano essere riconosciuti dal TCR.
Interazione MHC-TCR all’inizio di una risposta
immunitaria avviene fra APC e T cells.
MOLECULES OF T LYMPHOCYTE RECOGNITION
Glycoproteins expressed on the surface of cells. MHC class I is composed
of one polypeptide, non-covalently associated with b2microglobulin. MHC
class II is composed of two polypeptides, referred to as a and b.
CD8 T-CELL
CD4 T-CELL
a b
TCR ab
CD4
b1
MHC
CLASS II
b2
b
CD3
a1
a
CD8
15 aa
peptide
a2
ANTIGEN PRESENTING CELL
a b
TCR ab
a2
MHC
CLASS I
CD3
a3
a1
9 aa
peptide
b 2m
ANTIGEN PRESENTING CELL
MHC
Class I: HLA-A, -B, -C.
1 catena pesante con 3 domni --> altissimo
polimorfismo (1500 alleli)
b2-microglobulina
Class II: HLA-DR, -DP, -DQ.
1 catena a e 1 catena balto polimorfismo
Espressione solo su APC
From Janeway – Travers, Immuno Biologia, Piccin
MHC-I
MHC-II
From Janeway – Travers, Immuno Biologia, Piccin
Se è vero che il recettore dei
linfociti T (TCR) riconosce un
complesso formato da un peptide
antigenico non-self e da una
molecola MHC self...allora come
fanno alcuni linfociti T a rispondere
a MHC non self?
l linfociti T (attraverso il CD4 e CD8) riconoscono
solo alcuni residui peptidici degli MHC, alcuni di
questi residui sono simili in MHC diversi. In
condizioni fisiologiche non è possibile l'incontro di
un MHC non self, il problema si verifica
soprattutto nei trapianti.
L'organo trapiantato può infatti conservare alcune
APC che presentano quindi ai linfociti T
dell'organismo ricevente peptidi estranei su MHC
non self che vengono quindi riconosciuti a causa
della somiglianza d alcuni residui.
ALLOREATTIVITA’
10% delle T cells di un individuo sono in grado
di riconoscere molecole MHC di un donatore.
TRAPIANTI SOLIDI: T cell del ricevente
attaccano organo donato con MHC diverso.
TRAPIANTI DI MIDOLLO: T cell del donatore
riconoscono MHC del ricevente --> “tempesta”
di citochine --> GVHD
L’ALLORICONOSCIMENTO delle T cell avviene
ad alta frequnza: 1/10 vs. 1/106/7 per T antigene
specifiche.
Alloriconoscimento
•principale causa del rigetto di trapianti solidi;
•principale causa del GVHD (Graft Versus Host
Desease) in trapianti di midollo.
Giorno 0
2 ore teor i a
Giorno 1
1) Scomplementazione del siero
2) Preparazione terreni (compl, HAT,…)
3) Conta cells
4) Piastrare cells da sospensione: mieloma (per
fusione) e B16 (per congelamento Giorno 4)
Giorno 2
FUSIO N E
Giorno 3
MLR purificat i o n
Giorno 4
1) Preparazione soluzioni ELISA indiretto
2) Preparazione soluzioni ELISA sandwich
3) Distacco cellule in adesione e loro congelamen t o
Giorno 5
1) ELISA indiretto
2) Scongelamento cellule
3) Coating ELISA sandwic h
Giorno 6
ELISA Sandwich
Proposta quesiti
Giorno 7
Analisi ELISA sandwich
Risoluzione quesiti