conta del numero di cellule

• esigenze nutrizionali dei microrganismi
• meccanismi di assunzione dei nutrienti
• metodi di coltivazione dei microrganismi in laboratorio
Terreni sintetici (definiti): a composizione chimica definita; contengono il
minimo indispensabile per consentire la crescita di una particolare specie
batterica
Terreni complessi: a composizione chimica non definita; contengono
estratti di altre cellule (lievito) o di tessuti animali (Brain-Heart Infusion
Broth) o di piante (tryptic soy broth)
Terreni solidi: terreni liquidi sintetici o complessi + 1-2% di agar
AGAR: polisaccaride estratto dalle alghe che
gelifica a temperature inferiori ai 40°C.
Non tossico, non metabolizzabile dai microrganismi
uso dei terreni solidi
Terreni selettivi: terreni arricchiti con particolari composti per favorire la
crescita di specifici microrganismi o per sfavorire la crescita di altri
Terreni differenziali: terreni che permettono di differenziare alcune specie
batteriche da altre mettendo in evidenza particolari caratteristiche
metaboliche
- secrezione di proteasi: terreno contenente albumina (opaco).
alone chiaro intorno alla colonia che
degrada l’albumina
- attività emolitica:
(agar-sangue)
isolamento colture pure (striscio su piastra)
osservazione morfologia delle colonie (caratteristica di ogni specie)
conta batterica (conta vitale)
Figura 4.7 Tecnica della piastra per diffusione. Preparazione di una piastra per diffusione. (1)
Deporre con una pipetta una goccia di materiale al centro di una piastra contenente agar. (2)
Immergere un’apposita bacchetta di vetro in un beaker contenente etanolo. (3) Flambare per breve
tempo la bacchetta bagnata di etanolo e lasciarla raffreddare. (4) Distribuire uniformemente,
strisciando, il campione sulla superficie dell’agar mediante la bacchetta sterile. Incubare.
isolamento batteri da colture miste
Figura 4.9 Tecnica della
piastra per inclusione. Il
campione originale è sottoposto
a diluizioni seriali, in modo da
ridurre in misura sufficiente il
numero delle cellule microbiche
presenti. I campioni con la
diluizione più alta vengono
poimescolati con agar caldo,
quindi la miscela viene versata
in piastre di petri. Le cellule
isolate crescono formando
colonie e possono essere usate
per costituire colonie pure. Le
colonie in superficie sono
circolari, quelle al di sotto della
superficie in genere hanno
forma lenticolare.
crescita batterica
Crescita batterica
scissione binaria
Crescita batterica
gemmazione
Crescita batterica esponenziale:
1 cellula
No
Nt
n
2 cell.
4 cell.
8 cell.
= numero di cellule nella popolazione iniziale
= numero di cellule al tempo t
= numero di generazioni (numero di divisioni cellulari)
Nt = No x 2n
16 cell.
Batteri filamentosi
(crescita apicale)
(es. Streptomyces)
FASE DI LATENZA
• Fase di adattamento alle condizioni di crescita (temperatura,
terreno di coltura)
• N° di cellule costante nel tempo
• Durata variabile
FASE ESPONENZIALE (o LOGARITMICA)
• fase di duplicazione cellulare in cui la velocità di crescita è
costante e dipendente dalle condizioni di crescita
• N° di cellule aumenta nel tempo e tutte le cellule impiegano lo
stesso tempo per duplicarsi (TEMPO DI GENERAZIONE = tempo
impiegato da una cellula per duplicarsi))
• tempo di generazione è variabile e dipendente dalla specie
batterica e/o condizioni di crescita)
FASE STAZIONARIA
• Interruzione della crescita, N° di cellule costante nel tempo
(densità della popolazione batterica max 109 per ml)
•equlibrio tra divisione cellulare e morte
• accumulo di metaboliti tossici, scarsità di nutrienti
FASE DI MORTE
• diminuzione del numero di cellule vive nel tempo
• andamento in molti casi logaritmico (ogni ora muore una
percentuale costante di cellule)
• accumulo di metaboliti tossici, scarsità di nutrienti
Crescita batterica:
in fase esponenziale ogni microrganismo si duplica a intervalli di
tempo costanti, quindi la popolazione raddoppia nell’arco di un certo
tempo detto TEMPO DI GENERAZIONE:
N° cellule: 1
20
No
Nt
n
2
21
4
22
8
23
16
24
32.........
25
= numero di cellule nella popolazione iniziale
= numero di cellule al tempo t
= numero di generazioni (numero di divisioni cellulari)
Nt = No x 2n
(aumento di tipo esponenziale o logaritmico)
log Nt = log No + nlog2
n=
log Nt - log No =
log2
log Nt - log No
0,301
velocità di crescita = N° di generazioni nell’unità di tempo
k=n/t
k=
log Nt - log No
0,301 t
tempo di generazione (g) = tempo occorrente per una duplicazione cellulare
Nt = 2 No
in una generazione t = g
k = log (2 No) - log No = log2 + log No - log No
0,301 g
0,301 g
k = 0,301 + log No - log No = 1
0,301 g
g
g= 1
k
una popolazione batterica aumenta da 103 a
109 cellule in 10 ore.
calcolare la velocità di crescita (k) e il tempo
di generazione (g) e
graficamente: il tempo di generazione è
l’intervallo di tempo necessario per avere una
duplicazione cellulare
misura della crescita batterica
•misura della concentrazione
(conta del numero di cellule)
•misura della massa cellulare
cellulare
conta batterica totale
conta batterica vitale
conta batterica vitale
misura della massa cellulare:
valutazione delle torbidità
Figura 5.8 Torbidità e
misurazione della massa
microbica. Determinazione della
massa microbica tramite
misurazione dell’assorbimento
della luce. Al crescere della
popolazione, e quindi della torbidità,
aumenta la dispersione della luce
per cui aumentano i valori
dell’assorbanza forniti dallo
spettrofotometro. L’apparecchio
ha due scale: quella inferiore
mostra i valori dell’assorbanza;
quella superiore, la percentuale di
trasmittanza. L’assorbanza
aumenta al diminuire della
percentuale di trasmittanza.
la trasmittanza T diminuisce all’aumentare del numero di cellule
Lo spettrofotometro misura la densità ottica (OD= -logT)
direttamente proporzionale alla massa cellulare
misura della massa cellulare: misura del peso secco
cellule centrifugate per eliminare il sopranatante
asciugate in una stufa
pesate
coltura continua
le cellule sono mantenute costantemente
in fase esponenziale
Fattori che influenzano la crescita microbica:
• disponibilità di acqua
• concentrazione di soluti
• pH
• temperatura
• concentrazione di ossigeno
• pressione
• radiazioni
Fattori che influenzano la crescita microbica:
• disponibilità di acqua
• concentrazione di soluti
• pH
• temperatura
• concentrazione di ossigeno
• pressione
• radiazioni
microrganismi osmotolleranti: sintesi o assunzione di
soluti compatibili (colina, betaina, prolina, ac. glutammico)
la presenza di soluti influenza anche la disponibilità di acqua
la disponibilità di acqua viene espressa come attività dell'acqua
(valore max=1)
aw = Psol / Pacqua
dove Psol è la pressione di vapore della soluzione e
Pacqua è la pressione di vapore dell'acqua pura
la presenza di soluti fa diminuire l’attività dell’acqua
Fattori che influenzano la crescita microbica:
• disponibilità di acqua
• concentrazione di soluti
• pH
• temperatura
• concentrazione di ossigeno
• pressione
• radiazioni
gli osmotolleranti mantengono una
concentrazione elevata di soluti nel citoplasma
per trattenere l’acqua (sintesi di soluti
compatibili)
alofili estremi (Halobacterium) isolato nel mar
Nero richiede concentrazioni saline vicine alla
saturazione (elevato K+ intracellulare)
essiccazione, aggiunta di sale, come metodo
per la conservazione degli alimenti
Fattori che influenzano la crescita microbica:
• disponibilità di acqua
• concentrazione di soluti
• pH
• temperatura
• concentrazione di ossigeno
• pressione
• radiazioni
acidofili, neutrofili
basofili
pH citoplasmatico
mantenuto neutro
Fattori che influenzano la crescita microbica:
• disponibilità di acqua
• concentrazione di soluti
• pH
• temperatura
• concentrazione di ossigeno
• pressione
• radiazioni
influenza la velocità delle reazioni
psicrofili:
termofili:
enzimi efficienti
a basse T
enzimi termostabili
membrane con
acidi grassi
insaturi = +
fluide a bassa T
membrane con acid
grassi saturi =
aumenta il punto di
fusione
archea: legami
eterei e monostrato
Fattori che influenzano la crescita microbica:
• disponibilità di acqua
• concentrazione di soluti
• pH
• temperatura
• concentrazione di ossigeno
non
• pressione
necessitano di necessitano di
• radiazioni O2
O2
ignorano O2
muoiono in
presenza di O2
tollerano
basse
concentrazioni
di O2
O2 + e-
O2-*
ione superossido
O2-* + e-
H2O2
perossido di idrogeno
aerotolleranti
anaerobi
aerobi
2O2-* + 2H+
2 H2O2
2 H2O2 + NADH + H+
superossido
dismutasi
catalasi
perossidasi
O2 + H2O2
+
+
-
2H2O + O2
+
-
-
2H2O + NAD+
2 H2O2
acqua
ossigenata
2H2O + O2
produzione
di O2 per
attività
della
catalasi
Figura 5.17 Il sistema anaerobio GasPak. La busta GasPak libera idrogeno e
anidride carbonica. Il catalizzatore al palladio nel coperchio della camera catalizza la
formazione di acqua a partire da idrogeno e ossigeno, favorendo la rimozione
dell'ossigeno dalla camera sigillata ermeticamente.
Fattori che influenzano la crescita microbica:
• disponibilità di acqua
• concentrazione di soluti
• pH
• temperatura
• concentrazione di ossigeno
• pressione
• radiazioni
specie batteriche barotolleranti e barofile
Fattori che influenzano la crescita microbica:
• disponibilità di acqua
• concentrazione di soluti
• pH
• temperatura
• concentrazione di ossigeno
• pressione
• radiazioni
raggi X e raggi

, causano
rottura doppi legami e
legami idrogeno, danni al
DNA
Deinococcus radiodurans
endospore
raggi UV batteriche
crescita batterica in sistemi aperti (in ambiente naturale)
batteri non coltivabili (90-99 % dei batteri presenti in un habitat naturale)
Controllo dei microrganismi mediante agenti fisici e chimici
Sterilizzazione: eliminazione di tutte le cellule microbiche e di tutti i virus da un
determinato habitat
Disinfezione: eliminazione dei soli microrganismi patogeni
Sanificazione: riduzione della popolazione microbica a livelli considerati sicuri
Figura 6.1 Morte di
una popolazione
microbica. Il grafico
del numero di cellule
sopravvissute rispetto
ai minuti di esposizione
a una temperatura di
121 °C rivela un
andamento
esponenziale. In
questo esempio il
valore D121 è di 1
minuto.
Fattori che influenzano l'efficacia di un agente antimicrobico:
• dimensioni della popolazione
• composizione della popolazione
• concentrazione dell'agente antimicrobico
• durata dell'esposizione
• temperatura
• condizioni ambientali locali
maggiore è la dimensione della
popolazione e maggiore sarà il
tempo
necessario
all'agente
antimicrobico per svolgere la sua
azione
Metodi di controllo fisici:
• calore
• filtrazione
• radiazioni
Metodi di controllo fisici:
• calore
• filtrazione
• radiazioni
calore secco
calore umido
MISURA DELL’EFFICACIA DEL TRATTAMENTO:
TDP (thermal death point): la più bassa temperatura capace di uccidere
una sospensione microbica in 10 minuti
TDT (thermal death time): il minor tempo necessario ad uccidere tutti i
microrganismi di una sospensione ad una data temperatura ed in
condizioni ambientali definite
Tempo di riduzione decimale (valore D): il tempo necessario per
uccidere il 90% dei mirorganismi ad una certa temperatura
(o per ridurre il numero dei microrganismi vivi presenti in un campione di
10 volte (di un ordine di grandezza su scala logaritmica)
T = 121°C
D121= 1 min
Figura 6.1 Morte di una
popolazione microbica. Il
grafico del numero di cellule
sopravvissute rispetto ai minuti
di esposizione a una
temperatura di 121 °C rivela
un andamento esponenziale.
In questo esempio il valore
D121 è di 1 minuto.
Il valore D varia con la T e si
usa per stimare la resistenza
di un microrganismo alla
temperatura calcolando il
valore z
Il valore z: è l'aumento di temperatura necessario per ridurre il valore
D di 10 volte (di un ordine di grandezza su scala logaritmica)
aumentando la T diminuisce D
(cioè il tempo necessario per
uccidere il 90% dei batteri)
100 min
(a 100,5°C)
L’aumento di T necessario per
diminuire D di 10 volte rappresenta
il valore Z
10 min
( a 111°C)
Z=10,5 cioè un aumento di T di
10,5 °C permette di ridurre il
tempo di esposizione (D) di 10
volte(ottenendo la morte del 90%
dei batteri)
(121°C D=1 min)
nel caso di Clostridium botulinum
il trattamento termico deve essere tale da ridurre una popolazione di 1012 spore a 1
Il valore D per queste spore a 121°C è 0,204 minuti,
quindi serviranno 12D = 2,5 a 121°C per ridurre il numero di spore da 1012 a 1
il valore z per le spore di Clostridium botulinum è 10°C (cioè una variazione di
10°C provoca una variazione di 10 volte del valore D)
quindi se il trattamento termico viene fatto a 111°C e non a 121°C il tempo
necessario per ridurre il numero di spore da 1012 a 1 sarà 10 volte maggiore cioè
2,04 minuti e quindi il valore 12D sarà 25 minuti
AUTOCLAVE (sterilizzazione a calore umido)
Metodi di controllo fisici:
• calore
• filtrazione
• radiazioni
pastorizzazione: 63°C 30 min
pastorizzazione HTST (HighTemperatureShortTime): 72°C 15 sec
UHT (UltraHighTemperature): 150°C 2-3-sec
basse temperature
Metodi di controllo fisici:
• calore
• filtrazione
• radiazioni
filtri con pori da 0,2 e 0,1 m
per sostanze termolabili
Metodi di controllo fisici:
• calore
• filtrazione
• radiazioni
raggi UV per sterilizzare gli ambienti
raggi  per alcuni alimenti
Agenti di controllo chimici:
• fenolo e derivati
• alcooli
• alogeni
• metalli pesanti
• composti quaternari dell'azoto
• aldeidi
• sterilizzanti gassosi
Agenti di controllo chimici:
• fenolo e derivati
• alcooli
• alogeni
• metalli pesanti
• composti quaternari dell'azoto
• aldeidi
• sterilizzanti gassosi
Agenti di controllo chimici:
• fenolo e derivati
• alcooli
• alogeni
• metalli pesanti
• composti quaternari dell'azoto
• aldeidi
• sterilizzanti gassosi
Agenti di controllo chimici:
• fenolo e derivati
• alcooli
• alogeni
• metalli pesanti
• composti quaternari dell'azoto
• aldeidi
• sterilizzanti gassosi
Cl2
+
H2O
Ca(OCl)2+2H2O
HClO
HCl
fluoro, cloro, bromo, iodio
+
HClO acido ipocloroso
Ca(OH) 2 +
HClO acido ipocloroso
HCl + O
Agenti di controllo chimici:
• fenolo e derivati
• alcooli
• alogeni
• metalli pesanti (argento, arsenico, mercurio,....)
• composti quaternari dell'azoto (detergenti)
• aldeidi
• sterilizzanti gassosi
In 1 litro di coltura batterica contenente 1.00x103 cellule la velocità di crescita è 2 (tempo
in ore). Calcolare:
a) il numero di cellule per millilitro dopo 6 generazioni esponeneziali;
b) il tempo di generazione;
c) il tempo impiegato per effettuare le 6 generazioni esponenziali.
a)
Nt = No x 2n = 1x103 x 26 = 103 x 64 = 64x103 = 64,000 cellule totali
64 cellule per millilitro
b) g = 1/k = 1/2 = 0,5 ore = 30 minuti
c) t = g x n = 30 x 6 = 180 minuti = 3 ore
Coltiviamo in un litro di terreno di crescita 2x103 cellule di un ceppo batterico prelevate da
una coltura stazionaria. Il ceppo in esame ha le seguenti proprietà
Fase di latenza:
30 minuti.
Velocità di crescita (unità di tempo in ore):1
Calcolare:
a) il numero di cellule totale dopo 4 generazioni esponenziali
b) il tempo di generazione
c) il tempo totale impiegato per raggiungere il numero finale di cellule
a)
Nt = No x 2n = 2x103x24 = 2x103x16 = 32x103 = 32,000 cellule totali
b) g = 1/k = 1/1 = 1 ora = 60 minuti
c)
t = (g x n) + latenza = (60 minuti x 4) + 30 min = 240 minuti + 30 minuti =
= 270 min = 4,5 ore
In 100 millilitri di terreno di crescita il numero iniziale di cellule presenti è 2,00x103. Dopo
5 ore il numero di cellule è 1,28x105.
Calcolare:
a) il numero di generazioni necessarie per raggiungere il numero finale di cellule
b) la velocità di crescita
n = log Nt - log No = (5+log1,28) - (3+log2)= (5+0,1) - (3+0,3) =5,1-3,3 =1,8 = 6
0,301
0,301
0,301
0,301 0,301
2.000
4.000
8.000
16.000
32.000
64.000
128.000
k = n/t = 6/5 = 1,25(con il tempo espresso in ore) = 0,02(con il tempo espresso in minuti)
Indicate in che struttura cellulare ed in che tipo di organismi si trova la seguente molecola
H
H
C
O
(CH2) n
CH3
H
C
O
(CH2) n
CH3
H
C
OH
H
Indicate come può essere definito un terreno di crescita che contiene in un litro di acqua
distillata:
10 g di estratto di lievito
10 g di glucosio
5 g di estratto di fegato
3 g di K2HPO4
5 g di KH2PO4
200 mg di MgSO4
A)
B)
minimo a composizione chimica definita;
massimo a composizione chimica indefinita
................. Indicate quale dei seguenti metodi di conta batterica è adatto per determinare il numero di
batteri vivi presenti in un campione: A) misura spettrofotometrica; B) conta su piastra; C) conta diretta al
microscopio; D) determinazione del peso umido; E) determinazione del peso secco.
Nel metabolismo ........................ la fonte di energia é un composto chimico inorganico che si
.............................. cedendo elettroni ad un accettore finale degli elettroni.
Indicate se la frase seguente é corretta
o sbagliata ; in questo secondo caso sottolineate la parte
o le parti eventualmente sbagliate:
Le lipoproteine sono un costituente della parete cellulare dei Gram negativi. In particolare sono
associati alla faccia interna della membrana esterna e servono a collegare la membrana esterna
con la sottostante membrana citopasmatica
Indicate quali delle seguenti definizioni sono correttamente riferite ai batteri Gram-positivi, quali ai Gramnegativi e quali ad entrambi:
Gram-positivi
Gram-negativi
...................
..................
hanno una membrana esterna
...................
..................
sono impermeabili alla colorazione di Gram
...................
..................
contengono acidi teicoici
...................
.................
contengono peptidoglicano
...................
................
nei fosfolipi della membrana ci sono legami estere