...

scarica - Biotecnologie

by user

on
Category: Documents
26

views

Report

Comments

Transcript

scarica - Biotecnologie
Cinetica enzimatica
A
Specificità degli enzimi
• Specificità
–
–
–
–
Stereochimica
Assoluta
Di gruppo
Di legame
V.1.3 © gsartor 2001-2008
Cinetica enzimatica
-2-
Specificità degli enzimi
• Specificità stereochimica
steroide 11--monossigenasi
H
11
2
3
13
14
1
10
4
12
5
9
6
17
OH
16
15
2
8
7
3
HO
11
10
1
8
9
4
5
6
12
17
13
14
15
16
7
11--idrossi steroide
V.1.3 © gsartor 2001-2008
Cinetica enzimatica
-3-
Specificità degli enzimi
• Specificità assoluta
mannitolo-1-fosfato deidrogenasi
CH2OH
CH2OH
HO
H
O
HO
H
HO
H
H
OH
H
OH
H
OH
H
OH
CH2OPO3H-
CH2OPO3H-
mannitolo-1-fosfato
fruttoso-6-fosfato
V.1.3 © gsartor 2001-2008
Cinetica enzimatica
-4-
Specificità degli enzimi
• Specificità di gruppo
– Proteasi
…-Leu-Arg-Gly-Phe-…
Taglia qui
V.1.3 © gsartor 2001-2008
Cinetica enzimatica
-5-
Specificità degli enzimi
• Specificità di legame
– Esterasi
Estere  Acido + Alcool
V.1.3 © gsartor 2001-2008
Cinetica enzimatica
-6-
Classificazione degli enzimi
• Singolo enzima
– Ureasi
• Complesso enzimatico
– Complesso piruvato deidrogenasi
V.1.3 © gsartor 2001-2008
Cinetica enzimatica
-7-
Classificazione gerarchica degli enzimi
• Ogni enzima viene classificato a secondo della
reazione che catalizza.
• Viene classificato con un numero:
•
•
•
•
•
EC X.Y.Z.T
X = classe
Y = sottoclasse
Z = sotto-sottoclasse
T = numero dell’enzima nella sotto-sottoclasse
– http://www.genome.jp/dbget-bin/get_htext?ECtable+-f+T+w+A
– http://www.ebi.ac.uk/thornton-srv/databases/enzymes/
V.1.3 © gsartor 2001-2008
Cinetica enzimatica
-8-
Classificazione gerarchica degli enzimi
• Classi:
– 1. Ossidoreduttasi
• Catalizzano una reazione redox.
– 2. Transferasi
• Catalizzano il trasferimento di un gruppo da una
molecola ad un’altra:
X-Y + Z  X-Z + Y
le chinasi trasferiscono un gruppo fosfato.
– 3. Idrolasi
• Catalizzano la scissione idrolitica di legami C=O, C-N,
C-C, P-O-P,…
V.1.3 © gsartor 2001-2008
Cinetica enzimatica
-9-
Classificazione gerarchica degli enzimi
• Classi:
– 4. Liasi
• Catalizzano scissioni di legami con meccanismi diversi
dalle Ossidoreduttasi e dalle Idrolasi.
– 5. Isomerasi
• Catalizzano modificazioni geometriche.
– 6. Ligasi (Sintetasi)
• Catalizzano l’unione di due molecole accoppiata al
consumo di ATP o di un altro nucleotide trifosfato.
V.1.3 © gsartor 2001-2008
Cinetica enzimatica
- 10 -
Classificazione degli enzimi
1) Ossido-riduttasi
+
+
CH -CH -OH + NAD
3
CH -CH=O + NADH + H
2
3
ALCOHOL DEHYDROGENASE
2) Transferasi
O
CH OH
2
CH O
2
OH
ATP +
OH
HO
+ ADP
HO
OH
OH
V.1.3 © gsartor 2001-2008
O-
O
O -
++
Mg
O
P
HEXOKINASE
Cinetica enzimatica
OH
OH
- 11 -
Classificazione degli enzimi
3) Idrolasi
O
O
O
O
R-NH -CH-C-NH-CH-C-NH-R + H O
2
R-NH-CH-C-OH
+ NH -CH-C-NH-R
2
R
2
R1
R2
R1
PROTEASE
4) Liasi
CH -OH
2
-O
P O-C-H
C-O-O
O
O
V.1.3 © gsartor 2001-2008
CH
2
-O
+ HO
P O-C
2
O
C-O
ENOLASE
O
Cinetica enzimatica
O
- 12 -
Classificazione degli enzimi
5) Isomerasi
-O
O
P
O
O
O
C-O -
C-O -
O-C-H
H O-C-H
CH -OH
2
CH -O
2
TRIOSE PHOSPHATE ISOMERASE
O
P
O-
O
6) Ligasi
O
O
CH -C-OH + CoASH + ATP
3
V.1.3 © gsartor 2001-2008
CH -C-S-CoA + AMP + PPi
3
ACETYL CoA
SYNTHETASE
Cinetica enzimatica
- 13 -
Classificazione gerarchica degli enzimi
• Per esempio:
Alcool + NAD+  Aldeide o chetone + NADH
• Nome comune: alcool deidrogenasi
• Nome sistematico: alcool:NAD+ ossidoreduttasi
• EC 1.1.1.1
Numero dell’enzima nella sotto-sottoclasse
La sotto-sottoclasse – con NAD+ o NADP+ come accettori
La sottoclasse – Agiscono sul gruppo di donatori CH-OH
La classe - Ossidoreduttasi
V.1.3 © gsartor 2001-2008
Cinetica enzimatica
- 14 -
Isoenzimi
• Questa classificazione NON riguarda gli enzimi
in quanto proteine ma in quanto
CATALIZZATORI
• La classificazione riguarda quindi gli enziomi
che catalizzano una reazione.
• Proteine diverse (con diversa struttura
primaria) che catalizzano la stessa reazione,
sono
ISOENZIMI
V.1.3 © gsartor 2001-2008
Cinetica enzimatica
- 15 -
Isoenzimi
• Sono le forme multiple dovute a differenze,
determinate geneticamente, di struttura
primaria
• Sono anche isoenzimi quelle proteine che
svolgono la stessa funzione ma sono
geneticamente indipendenti, per esempio:
• EC 1.1.1.37 malato deidrogenasi
– Citosolica (codificata dal DNA nucleare)
– Mitocondriale (codificata dal DNA mitocondriale)
V.1.3 © gsartor 2001-2008
Cinetica enzimatica
- 16 -
Spontaneità
• Una qualunque reazione chimica avviene
se e solo se la
variazione di energia libera (G) è
negativa:
spontaneamente
GT,p < 0
GT = H – TS
• A T e p costanti
V.1.3 © gsartor 2001-2008
Cinetica enzimatica
- 17 -
Spontaneità
• Quindi, data una qualunque reazione chimica
AB
• Essa avviene spontaneamente se le energie
libere molari
GB < GA
• Più in generale qualunque trasformazione
avviene se e solo se:
Gfinale < Giniziale
V.1.3 © gsartor 2001-2008
Cinetica enzimatica
- 18 -
Spontaneità ed equilibrio
• Quando
GB = GA
• Quindi
G = 0
• La reazione è all’equilibrio
A
V.1.3 © gsartor 2001-2008
B
Cinetica enzimatica
- 19 -
Spontaneità e realtà
• Questo non significa che una reazione chimica (un
processo) esoergonica (G < 0) avvenga con velocità
O
O
O
apprezzabile.
P
O
ATP + H2O
H
..
O
O
O
P
O
P
O
O
O
HO
H
N
O
NH2
N
OH
N
N

O
ADP + Pi
O
O
P
O
O
+
G°’ = -7.3 kcal·mole-1 (-30.6 kJ·mole-1) a pH 7
G° = -10 kcal·mole-1 (-42 kJ·mole-1) a pH 9
V.1.3 © gsartor 2001-2008
Cinetica enzimatica
O
P
O
O
O
P O
O
N
O
HO
NH2
N
OH
N
N
- 20 -
Energia di attivazione
• In soluzione l’ATP è stabile perché
esiste l’energia di attivazione.
V.1.3 © gsartor 2001-2008
Cinetica enzimatica
- 21 -
Catalisi
• In assenza di catalizzatore:
A+BC+D
V.1.3 © gsartor 2001-2008
Cinetica enzimatica
- 22 -
Catalisi
Energia libera
G* = Energia di attivazione
G*
A+B
G
C+D
Coordinate di reazione
V.1.3 © gsartor 2001-2008
Cinetica enzimatica
- 23 -
Catalisi
• In presenza di catalizzatore:
A + K  AK
AK + B  ABK
ABK  C + D + K
V.1.3 © gsartor 2001-2008
Cinetica enzimatica
- 24 -
Catalisi
Energia libera
G*c = Energia di attivazione in presenza di catalizzatore
G*c
A+B+K
G
AK + B
C+D+K
Coordinate di reazione
V.1.3 © gsartor 2001-2008
Cinetica enzimatica
- 25 -
Controllo termodinamica e
controllo cinetico di una reazione
• Ogni reazione può avvenire se e solo se è
termodinamicamente favorita (G < 0),
• Avviene se e solo se vi è abbastanza energia per
superare l’energia di attivazione:
H202  H2O + ½ O2
• Catalizzatore :
– Nessuno H* = 18 kcal·mole-1
– Platino
H* = 11.7 kcal·mole-1
– Catalasi H* = 5.5 kcal·mole-1
(H* = energia di attivazione)
V.1.3 © gsartor 2001-2008
Cinetica enzimatica
- 26 -
Cinetica chimica
27
• Velocità di reazione
• k è la costante di velocità
• m ed n sono coefficienti che possono essere pari a zero, numeri interi o frazionari,
il cui valore può essere determinato solo sperimentalmente
• Ogni coefficiente determina l' ordine di reazione, rispetto al proprio componente
• la somma m+n determina l'ordine globale della reazione
V.1.3 © gsartor 2001-2008
Cinetica enzimatica
- 27 -
Cinetica chimica
m
n
ordine globale di
reazione
0
0
0
1
0
1
0
1
1
2
0
2
1
1
2
V.1.3 © gsartor 2001-2008
Cinetica enzimatica
2
legge cinetica
- 28 -
Cinetica chimica
29
• Qual’ è l’ordine globale di reazione?
• Se sperimentalmente si trova che la velocità di reazione
è direttamente proporzionale a [A]2 e a [B]
• allora la reazione è di 2° ordine rispetto ad A e di 1°
ordine rispetto a B
• La reazione è globalmente di 3° ordine
V.1.3 © gsartor 2001-2008
Cinetica enzimatica
- 29 -
Fattori che influenzano la velocità
di reazione
• Temperatura
• pH
• Concentrazione dell’enzima
• Concentrazione del substrato
• Nel caso di enzimi allosterici anche
la presenza di modulatori positivi e
negativi
V.1.3 © gsartor 2001-2008
Cinetica enzimatica
- 30 -
Temperatura
V.1.3 © gsartor 2001-2008
Cinetica enzimatica
- 31 -
pH
V.1.3 © gsartor 2001-2008
Cinetica enzimatica
- 32 -
[E]
V.1.3 © gsartor 2001-2008
Cinetica enzimatica
- 33 -
[S]
Se mettiamo in grafico V in funzione di [S], troviamo che:
•A bassi valori di [S], la velocità V, aumenta quasi linearmente
con l’aumentare di [S].
•Ma come [S] aumenta, gli aumenti di V diventano via via più
piccoli (iperbole rettangolare).
•L’asintoto rappresenta la velocità massima della reazione,Vmax
•La concentrazione di substrato che produce una V che è la
metà di Vmax è detta costante di Michaelis-Menten, Km.
V.1.3 © gsartor 2001-2008
Cinetica enzimatica
- 34 -
V.1.3 © gsartor 2001-2008
Cinetica enzimatica
- 35 -
Grafico di Michaelis-Menten
V.1.3 © gsartor 2001-2008
Cinetica enzimatica
- 36 -
Cinetica enzimatica
1
• 1913: Michaelis e Menten
V.1.3 © gsartor 2001-2008
Cinetica enzimatica
- 37 -
In una reazione chimica
Velocità di reazione
AB
v = k · [A]
[A]
V.1.3 © gsartor 2001-2008
Cinetica enzimatica
- 38 -
In una reazione enzimatica
E+S
ES
Velocità di reazione
Bassa concentrazione
di substrato
E+P
Alta concetrazione
di substrato
v = k'' [Eo]
v = k' [Eo][S]
[S]
V.1.3 © gsartor 2001-2008
Cinetica enzimatica
- 39 -
Enzima e substrato
•
In una reazione tra enzima (E) e substrato (S),
possiamo distinguere tre fasi:
1. Legame tra E e S per formare il complesso ES
E + S  ES
[E]>>[S]
Stato prestazionario
2.
d[ES]
dt
Stato stazionario
= 0;
3. Scompare il substrato, [ES] diminuisce, v diminuisce
V.1.3 © gsartor 2001-2008
Cinetica enzimatica
- 40 -
Enzima e substrato
1a fase
Stato
Pre-stazionario
2a fase
Stato stazionario
3a fase
Fine
Concentrazione
[S]
[P]
d[P]/dt  cost.
[ES]
[ES]/t ≈ 0
[E]
Tempo
V.1.3 © gsartor 2001-2008
Cinetica enzimatica
- 41 -
Enzima e substrato
1a fase
Stato
Pre-stazionario
2a fase
Stato stazionario
3a fase
Fine
Concentrazione
[S]
[P]
d[P]/dt  cost.
[ES]
[ES]/t ≈ 0
[E]
Tempo
V.1.3 © gsartor 2001-2008
Cinetica enzimatica
- 42 -
Enzima e substrato
Velocità di reazione
• In una reazione enzimatica
l’ordine di reazione è variabile
v = k[E][S]
Ordine 1
v = k[E]
Pseudo ordine 0
[S]
V.1.3 © gsartor 2001-2008
Cinetica enzimatica
- 43 -
Enzima e substrato
• In una reazione enzimatica
l’ordine di reazione è variabile
Ordine 1
Ordine 0
[S]
[S]
V.1.3 © gsartor 2001-2008
Cinetica enzimatica
- 44 -
Trattamento secondo Michaelis e Menten
• In una reazione enzimatica:
k1
E+S
k-1
ES
k2
ES
E+P
(veloce)
(1)
(lento)
(2)
vdiretta = k2[ES]
• Per l’equilibrio veloce (1)
K=
INDETERMINABILE
k1
k-1
[ES] =
V.1.3 © gsartor 2001-2008
=
k1
k-1
[ES]
[E][S]
INDETERMINABILE
[E][S]
k2<<k-1
Cinetica enzimatica
- 45 -
V.1.3 © gsartor 2001-2008
Cinetica enzimatica
- 46 -
Trattamento secondo Michaelis e Menten
• Per l’equilibrio veloce (1)
K=
k1
k-1
[ES] =
=
[ES]
[E][S]
INDETERMINABILE
k1
k-1
[E][S]
[Etot] misurabile
[Etot] = [E] + [ES]
[ES] =
V.1.3 © gsartor 2001-2008
k1
k-1
([Etot]-[ES]) [S]
Cinetica enzimatica
- 47 -
Trattamento secondo Michaelis e Menten
• Da cui
[ES] =
[Etot][S]
k-1
k1
k-1
k1
ES
+ [S]
= Kd
Costante di dissociazione
del complesso ES
k-1
E+S
k1
[E][S]
[ES]
V.1.3 © gsartor 2001-2008
= Kd = K M
Cinetica enzimatica
Costante di
Michaelis e Menten
- 48 -
Trattamento secondo Michaelis e Menten
• La concentrazione del complesso ES
[ES] =
[Etot][S]
KM + [S]
• Poiché:
vdiretta = k2[ES]
vdiretta =
V.1.3 © gsartor 2001-2008
k2[Etot][S]
KM + [S]
Cinetica enzimatica
- 49 -
Trattamento secondo Michaelis e Menten
• Quando tutto Etot diventa ES allora la velocità sarà massima.
Vmax = k2[Etot]
v=
Vmax[S]
KM + [S]
• Quando il substrato satura l’enzima allora la velocità sarà
massima
V.1.3 © gsartor 2001-2008
Cinetica enzimatica
- 50 -
Equazione di Michaelis e Menten
v=
V.1.3 © gsartor 2001-2008
Vmax[S]
KM + [S]
Cinetica enzimatica
- 51 -
Michaelis e Menten
Leonor Michaelis (1875-1949)
V.1.3 © gsartor 2001-2008
Maud Menten (1879-1960)
Cinetica enzimatica
- 52 -
Trattamento secondo Michaelis e
Menten
Velocità di reazione
Bassa concentrazione
(relativamente) di substrato:
[S]<<KM (Ordine 1)
v=
Vmax[S]
KM
Alta concentrazione di substrato:
[S]>>KM (Ordine 0)
v=
Vmax[S]
[S]
= Vmax
[S]
V.1.3 © gsartor 2001-2008
Cinetica enzimatica
- 53 -
Trattamento secondo Briggs-Haldane
• Da un punto di vista formale il trattamento è lo stesso di M.M.,
cambia il significato cinetico di KM
k1
E+S
k2
ES
k-2
k-1
E+P
• Allo stato stazionario:
d[ES]
dt
[ES] =
k1[E][S]
(k-1 + k2)
V.1.3 © gsartor 2001-2008
= 0 = k1[E][S] - (k-1[ES] + k2[ES])
formazione di ES
v=
Cinetica enzimatica
scomparsa di ES
Vmax[S]
KM + [S]
KM =
k-1 + k2
k1
- 54 -
Significato di KM
• KM descrive l’interazione substrato-enzima a livello del
sito di legame.
• KM è, dimensionalmente, una concentrazione:
KM = Kd =
k-1
k1
=
[E][S]
[ES]
; moli l-1
• È la concentrazione di substrato al quale la velocità della
reazione è metà della Vmax
v=
Vmax
2
=
Vmax[S]
KM + [S]
;
[S]
1
=
;
2
KM + [S]
KM = [S]
V.1.3 © gsartor 2001-2008
Cinetica enzimatica
- 55 -
Significato di Vmax
E+S
k1
ES
k-1
k2
k-2
E+P
• Vmax è legata a k2
Vmax = k2[Etot]
• Dipende dalla concentrazione dell’enzima
(induzione).
V.1.3 © gsartor 2001-2008
Cinetica enzimatica
- 56 -
Significato di k2
• k2 è una frequenza
Vmax/[Etot] = k2 (moli·l-1·s-1)/(moli·l-1)
k2 = s-1
• Numero di eventi per unità di tempo (numero
di turnover).
• Proprietà cinetica dell’enzima.
V.1.3 © gsartor 2001-2008
Cinetica enzimatica
- 57 -
Efficienza catalitica o numero di turnover
• k2 è detta anche kcat e si ottiene:
kcat =
Vmax
[Etot]
• k2 è detto anche numero di turnover (Moli di substrato
consumate per secondo per moli di enzima) si esprime in s-1.
~1 s-1 < k2 < 106 s-1
V.1.3 © gsartor 2001-2008
Cinetica enzimatica
- 58 -
Significato di KM e Vmax
v = Vmax
v=
v
Vmax[S]
KM
Vmax
2
KM
V.1.3 © gsartor 2001-2008
[S]
Cinetica enzimatica
- 59 -
Enzima
Sorgente
Substrato
Km (mM)
Acetil-CoA sintasi
Cuore di bue
Acetato
1.400
ATP-asi
Muscolo di coniglio
ATP
0.014
Alcool deidrogenasi
Fegato di cavallo
Etanolo
0.500
Anidrasi carbonica
Eritrociti
Anidride carbonica
7.500
Acido aspartico
0.900
Acido a-chetoglutarico
0.100
Acido ossalacetico
0.040
acido glutammico
4.000
Butirril-CoA
0.014
N-benziltirosinamide
2.500
N-formiltirosinamide
12.000
N-acetiltirosinamide
32.000
Aspartato aminotransferasi
Butirril-CoA deidrogenasi
Chimotripsina
Cuore di maiale
Fegato di bue
Pancreas bovino
gliciltirosinamide
Muscolo di coniglio
Creatina
19.000
Esochinasi
Lievito
Glucosio
0.150
Esochinasi
Cervello
Glucosio
0.008
Fosfatasi acida
Prostata
a-glicerofosfato
3.000
Fosfogliceraldeide deidrogenasi
Muscolo di coniglio
Gliceraldeide-3-fosfato
0.050
Acido glutammico
0.120
Acido a-chetoglutarico
2.000
Xantina ossidasi
V.1.3 © gsartor 2001-2008
Fegato bovino
Latte
Ione ammonio
57.000
NAD+
0.025
NADH
0.018
Xantina
0.030
Acetaldeide
Cinetica enzimatica
1000000
122.000
Creatina fosfochinasi
Glutamato deidrogenasi
n° di turnover
(1/s)
1000.000
- 60 -
Enzima
Sorgente
Substrato
Km (mM)
Acetil-CoA sintasi
Cuore di bue
Acetato
1.400
ATP-asi
Muscolo di coniglio
ATP
0.014
Alcool deidrogenasi
Fegato di cavallo
Etanolo
0.500
Anidrasi carbonica
Eritrociti
Anidride carbonica
7.500
Acido aspartico
0.900
Acido a-chetoglutarico
0.100
Acido ossalacetico
0.040
acido glutammico
4.000
Butirril-CoA
0.014
N-benziltirosinamide
2.500
N-formiltirosinamide
12.000
N-acetiltirosinamide
32.000
Aspartato aminotransferasi
Butirril-CoA deidrogenasi
Chimotripsina
Cuore di maiale
Fegato di bue
Pancreas bovino
gliciltirosinamide
Muscolo di coniglio
Creatina
19.000
Esochinasi
Lievito
Glucosio
0.150
Esochinasi
Cervello
Glucosio
0.008
Fosfatasi acida
Prostata
a-glicerofosfato
3.000
Fosfogliceraldeide deidrogenasi
Muscolo di coniglio
Gliceraldeide-3-fosfato
0.050
Acido glutammico
0.120
Acido a-chetoglutarico
2.000
Xantina ossidasi
V.1.3 © gsartor 2001-2008
Fegato bovino
Latte
Ione ammonio
57.000
NAD+
0.025
NADH
0.018
Xantina
0.030
Acetaldeide
Cinetica enzimatica
1000000
122.000
Creatina fosfochinasi
Glutamato deidrogenasi
n° di turnover
(1/s)
1000.000
- 61 -
Enzima
Sorgente
Substrato
Km (mM)
Acetil-CoA sintasi
Cuore di bue
Acetato
1.400
ATP-asi
Muscolo di coniglio
ATP
0.014
Alcool deidrogenasi
Fegato di cavallo
Etanolo
0.500
Anidrasi carbonica
Eritrociti
Anidride carbonica
7.500
Acido aspartico
0.900
Acido a-chetoglutarico
0.100
Acido ossalacetico
0.040
acido glutammico
4.000
Butirril-CoA
0.014
N-benziltirosinamide
2.500
N-formiltirosinamide
12.000
N-acetiltirosinamide
32.000
Aspartato aminotransferasi
Butirril-CoA deidrogenasi
Chimotripsina
Cuore di maiale
Fegato di bue
Pancreas bovino
gliciltirosinamide
Muscolo di coniglio
Creatina
19.000
Esochinasi
Lievito
Glucosio
0.150
Esochinasi
Cervello
Glucosio
0.008
Fosfatasi acida
Prostata
a-glicerofosfato
3.000
Fosfogliceraldeide deidrogenasi
Muscolo di coniglio
Gliceraldeide-3-fosfato
0.050
Acido glutammico
0.120
Acido a-chetoglutarico
2.000
Xantina ossidasi
V.1.3 © gsartor 2001-2008
Fegato bovino
Latte
Ione ammonio
57.000
NAD+
0.025
NADH
0.018
Xantina
0.030
Acetaldeide
Cinetica enzimatica
1000000
122.000
Creatina fosfochinasi
Glutamato deidrogenasi
n° di turnover
(1/s)
1000.000
- 62 -
Linearizzazione dell’equazione di
Michaelis e Menten
V.1.3 © gsartor 2001-2008
Cinetica enzimatica
- 63 -
Lineweaver-Burk
v=
Vmax[S]
KM + [S]
• Inversione
KM + [S]
KM
1
=
=
v
Vmax
Vmax[S]
V.1.3 © gsartor 2001-2008
Cinetica enzimatica
1
[S]
+
1
Vmax
- 64 -
Lineweaver-Burk
KM
1
=
v
Vmax
1
[S]
+
1
Vmax
1/v
1/Vmax
Pendenza = KM/Vmax
-1/KM
V.1.3 © gsartor 2001-2008
0
1/[S]
Cinetica enzimatica
- 65 -
Eadie-Hofstee
• Trasformazione
v (KM + [S]) = Vmax[S]
vKM + v[S] = Vmax[S]
vKM
[S]
v[S]
+
vKM
[S]KM
[S]
+
v
KM
Vmax/KM
v/[s]
= Vmax
=
Pendenza = - 1/KM
Vmax
Vmax
KM
Vmax
v
1
=
-v
[S]
KM
KM
V.1.3 © gsartor 2001-2008
v
Cinetica enzimatica
- 66 -
Eadie-Hofstee (oppure)
• Trasformazione
v (KM + [S]) = Vmax[S]
vKM + v[S] = Vmax[S]
vKM
[S]
v[S]
+
vKM
[S]KM
[S]
+
v = -KM
V.1.3 © gsartor 2001-2008
v
KM
Vmax
v
= Vmax
=
Pendenza = - KM
Vmax
Vmax/KM
KM
v
+ Vmax
[S]
v/[s]
Cinetica enzimatica
- 67 -
Reazioni enzimatiche con più substrati
• Meccanismo sequenziale: i substrati si legano in modo
sequenziale:
• Prima uno poi l’altro in ordine preciso:
– Meccanismo sequenziale ordinato
• Senza un ordine preciso:
– Meccanismo sequenziale casuale
• Meccanismo a ping-pong
V.1.3 © gsartor 2001-2008
Cinetica enzimatica
- 68 -
Meccanismo sequenziale ordinato
E
P+Q
A+B
E+A
EA;
EAB
EPQ;
EA + B
EAB;
EPQ
EQ + P;
E+Q
EQ
V.1.3 © gsartor 2001-2008
Cinetica enzimatica
- 69 -
Meccanismo sequenziale casuale
E
A+B
E+A
EA
A
E+B
V.1.3 © gsartor 2001-2008
P+Q
Q
B
EAB
EB
EPQ
EP
P
EQ
Cinetica enzimatica
E+P
E+Q
- 70 -
Meccanismo a ping-pong
E
P+Q
A+B
E+A
EA
E'P
E' + P
E' + B
E'B
EQ
E+Q
P
A
E
E'A
V.1.3 © gsartor 2001-2008
E'P
Q
B
E'
Cinetica enzimatica
E'B
EQ
E
- 71 -
Meccanismo a ping-pong
• Così funziona l’esochinasi
E
ADP + Glucoso-6-P
ATP + D-glucoso
ADP
ATP
E
EATP
EP
E-P-glucoso
D-glucoso
V.1.3 © gsartor 2001-2008
Cinetica enzimatica
E-glucoso-P
E
glucoso-6-P
- 72 -
Esempio
1) Saccarosio fosforilasi
glucosio-fruttosio + fosfato  glucosio-1-fosfato + fruttosio
Esperimento di scambio isotopico:
glucosio-fruttosio + fruttosio*  glucosio-fruttosio* + fruttosio
Il meccanismo è a ping pong
1) Maltosio fosforilasi
glucosio-glucosio + fosfato  glucosio-1-fosfato + glucosio
Esperimento di scambio isotopico:
glucosio-glucosio + glucosio*  glucosio-glucosio + glucosio
V.1.3 © gsartor 2001-2008
Il meccanismo è sequenziale
Cinetica enzimatica
- 73 -
Es. Meccanismo sequenziale ordinato:
reazioni aventi NAD+ e NADH come
substrati
La lattato deidrogenasi catalizza questa reazione: si lega prima il coenzima
che viene anche rilasciato per primo. La sequenza di eventi è ben
rappresentata con il sistema sviluppato da W.Wallace Cleland:
L’enzima forma sempre un complesso ternario: prima costituito dall’ enzima
e dai substrati e dopo la catalisi dall’ enzima e dai prodotti
V.1.3 © gsartor 2001-2008
Cinetica enzimatica
- 74 -
Nel meccanismo
sequenziale casuale
l’ordine con cui i
substrati vengono
legati e i prodotti
rilasciati è casuale
La creatina chinasi catalizza questa reazione. Anche in
questo caso la sequenza della reazione può essere
rappresentata con il sistema di Cleland
V.1.3 © gsartor 2001-2008
Cinetica enzimatica
- 75 -
Reazioni a doppio spiazzamento
(ping pong)
Uno o più prodotti vengono rilasciati prima che
tutti i substrati si siano legati all’enzima. La
caratteristica di questo tipo di reazione è la
presenza di un intermedio costituito
dall’enzima modificato.
Un classico esempio sono gli
scambi di gruppi amminici tra
amminoacidi e α-chetoacidi.
L’enzima aspartato amminotransferasi catalizza questa
reazione
V.1.3 © gsartor 2001-2008
Cinetica enzimatica
- 76 -
La sequenza degli eventi può essere rappresentata dal seguente sistema:
Nel sistema di Cleland i substrati
entrano ed escono dall’enzima
come una pallina di ping-pong su
un tavolo da gioco
V.1.3 © gsartor 2001-2008
Cinetica enzimatica
- 77 -
Reazioni enzimatiche con più substrati
• Il trattamento è complesso, occorre fare lo studio cinetico
tenendo fissa la concentrazione di uno dei substrati (B) variando
l’altro (A), così, di grafici di Lineweaver-Burk si può avere una
descrizione del meccanismo:
[B]
1/v
[B]
1/v
1/[A]
Sequenziale casuale
V.1.3 © gsartor 2001-2008
1/[A]
Ping-pong
Cinetica enzimatica
- 78 -
Regolazione dell’attività enzimatica
• I fattori che regolano l’attività enzimatica sono:
– Temperatura
• Enzimi solubili o di membrana
– pH
– Effettori
• Inibitori (inattivatori)
• Attivatori
• Effetti allosterici
– Concentrazione di substrati e prodotti
• Vie metaboliche
– Repressione o induzione genica
V.1.3 © gsartor 2001-2008
Cinetica enzimatica
- 79 -
Temperatura
• La velocità delle reazioni chimiche dipende dalla
temperatura.
• La stabilità di una proteina dipende dalla temperatura.
Velocità
Denaturazione
Aumento cinetico
optimum
Temperatura
V.1.3 © gsartor 2001-2008
Cinetica enzimatica
- 80 -
Temperatura
• La temperatura influenza la fluidità di membrana
Enzima solubile
Ln v
Ln v
Temperatura
alta
V.1.3 © gsartor 2001-2008
Enzima di membrana
1/T
Temperatura
bassa
Temperatura
alta
Cinetica enzimatica
Temperatura
di transizione
della fase lipidica
1/T
Temperatura
bassa
- 81 -
pH
• La stabilità di una proteina dipende dal pH.
• Alcuni processi coinvolgono valori estremi di pH
Tripsina
Aceticolinesterasi
Velocità relativa
Pepsina
2
V.1.3 © gsartor 2001-2008
6
pH
Cinetica enzimatica
10
- 82 -
Effettori
• Attivatori
• Inibitori
• La differenza non è netta, la stessa molecola
può funzionare in entrambi i modi a seconda
delle condizioni
–
–
–
–
Carica
Concentrazione
Enzima legato ad altre molecole
…
V.1.3 © gsartor 2001-2008
Cinetica enzimatica
- 83 -
Inibitori
• Si definiscono inibitori quelle molecole che diminuiscono
l’attività di un enzima, possono dare
• Inibizione reversibile
– Modificano in modo reversibile (in genere attraverso un
legame non covalente) l’enzima
• Inibizione irreversibile
– Modificano in modo irreversibile l’enzima
V.1.3 © gsartor 2001-2008
Cinetica enzimatica
- 84 -
Inibitori reversibili
• A secondo delle loro caratteristiche si
definiscono:
– Inibitori competitivi
– Inibitori non competitivi
– Inibitori acompetitivi
V.1.3 © gsartor 2001-2008
Cinetica enzimatica
- 85 -
Inibitori competitivi
• Agiscono competendo con il substrato per lo
stesso sito di legame, agiscono quindi sulla
formazione del complesso ES.
• L’inibizione è rimossa aumentando la
concentrazione di S
KM
ES
S
E+
[S][E]
E+P
KM =
Ki
I
V.1.3 © gsartor 2001-2008
EI
E+P
Cinetica enzimatica
Ki =
[ES]
[I][E]
[EI]
- 86 -
Inibitori competitivi
• Senza inibitore
KM + [S]
v
v=
Vmax [S]
• Con inibitore
Vmax [S]
v=
KM ( 1 +
V.1.3 © gsartor 2001-2008
[I]
Ki
[S]
) + [S]
Cinetica enzimatica
- 87 -
• Senza inibitore
KM
1
=
v
Vmax
1
[S]
+
1/V
Inibitori competitivi
1
Vmax
1/Vmax
-1/KM(app)
0
1/[S]
• Con inibitore
1
[I]
1
KM
1
=
(1+
)
+
v
Vmax
Vmax
Ki
[S]
V.1.3 © gsartor 2001-2008
Cinetica enzimatica
- 88 -
Inibitori competitivi
SUBSTRATO
INIBITORE
• Sono molecole simili
al substrato
• Occupano lo stesso
sito di legame
SITO ATTIVO
DELL’INZIMA
PRODOTTI
SUBSTRATO ED
INIBITORE SI
LEGANO ALLO
STESSO SITO
IL LEGAME
DELL’INIBITORE
PREVIENE IL
LEGAME DEL
SUBSTRATO
V.1.3 © gsartor 2001-2008
Cinetica enzimatica
- 89 -
Inibitori competitivi
• Sono molecole simili
al substrato
• Occupano lo stesso
sito di legame
V.1.3 © gsartor 2001-2008
Cinetica enzimatica
- 90 -
Inibitori non competitivi
• Agiscono legandosi in un sito diverso dal sito di legame
del substrato il quale può comunque legarsi.
• L’inibizione NON è rimossa aumentando la
concentrazione di S
KM
E+P
ES
E+S
+I
+I
Ki
Ki
KM
EI + S
V.1.3 © gsartor 2001-2008
Ki =
ESI
Cinetica enzimatica
[S][E]
KM =
[I][E]
[EI]
[ES]
=
[I][ES]
[ESI]
- 91 -
Inibitori non competitivi
• Senza inibitore
KM + [S]
v
v=
Vmax [S]
• Con inibitore
Vmax
(1+
v=
[I]
Ki
[S]
[S]
)
KM + [S]
V.1.3 © gsartor 2001-2008
Cinetica enzimatica
- 92 -
• Senza inibitore
KM
1
=
v
Vmax
1
[S]
+
1/V
Inibitori non competitivi
1
Vmax
1/Vmax
• Con inibitore
-1/KM
0
1/[S]
[I]
1
[I]
1
KM
1
=
(1+
)
+
(1+
)
v
V
Ki
Vmax
Ki
[S]
max
V.1.3 © gsartor 2001-2008
Cinetica enzimatica
- 93 -
Inibitori non competitivi
INIBITORE
SITO ATTIVO
DELL’INZIMA
• Sono molecole diverse
dal substrato, si
SITO INIBITORIO
legano ad un proprio (REGOLATORIO)
sito
(Cu++)
• Ioni metallici
• Complessanti (EDTA)
• Modulatori
V.1.3 © gsartor 2001-2008
IN ASSENZA
DI INBITORE SI
FORMANO
I PRODOTTI
Cinetica enzimatica
SUBSTRATO
SUBSTRATO ED
INIBITORE SI
LEGANO A
SITI DIVERSI
LA PRESENZA
DELL’INIBITORE
RIDUCE LA
VELOCITÀ DI
FORMAZIONE
DEL PRODOTTO
- 94 -
Inibitori acompetitivi
• Agiscono legandosi e bloccando il complesso
enzima-substrato.
KM
E+S
[S][E]
E+P
ES
KM =
+I
Ki
Ki =
[ES]
[I][ES]
[ESI]
ESI
V.1.3 © gsartor 2001-2008
Cinetica enzimatica
- 95 -
Inibitori acompetitivi
v
• Senza inibitore
Vmax [S]
v=
KM + [S]
• Con inibitore
Vmax
[I]
(1+
v=
Ki
[S]
)
KM
(1+
V.1.3 © gsartor 2001-2008
[I]
Ki
[S]
+ [S]
)
Cinetica enzimatica
- 96 -
1/V
Inibitori acompetitivi
• Senza inibitore
KM
1
=
v
Vmax
1
[S]
+
1
Vmax
1/Vmax
• Con inibitore
0
-1/KM(app)
1
KM
1
=
+
v
Vmax
[S]
V.1.3 © gsartor 2001-2008
1
Vmax
(1+
Cinetica enzimatica
[I]
Ki
1/[S]
)
- 97 -
Riassumendo…
KM
• Inibizione
competitiva
[S][E]
E+P
ES
E+S
KM =
+I
Ki =
Ki
EI + S
Ki' =
KM
• Inibizione non
competitiva
E+S
ES
+I
+I
[ES]
[I][E]
[EI]
[I][ES]
[ESI]
E+P
Ki'
Ki
KM
EI + S
ESI
KM
E+S
• Inibizione
acompetitiva
E+P
ES
+I
Ki'
ESI
V.1.3 © gsartor 2001-2008
Cinetica enzimatica
- 98 -
…riassumendo
a = (1 +
[I]
Ki
)
a' = (1 +
[I]
Ki'
Tipo di inibizione
VMAXapp
KMapp
Nessuna
VMAX
KM
Competitiva
VMAX
aKM
Non competitiva
VMAX/a’
aKM /a’
Acompetitiva
VMAX /a’
KM /a’
V.1.3 © gsartor 2001-2008
Cinetica enzimatica
)
- 99 -
Inibitori irreversibili
Inibitore
Formula
Origine
Meccanismo
CN-
Mandorle
amare
Complessa gli ioni
metallici nelle
proteine
Sintetico
Inibisce gli enzimi
con serina nel sito
attivo
Sintetico
Come il DFP
Frutto del
calabar
Come il DFP
Ione cianuro
Diisopropil
fluorofosfato
(DFP)
CH3
H3C
O
CH3
F
P
O
O
CH3
Sarin
H3C
H3C
Fisostigmina
H
N
O
O
CH3
F
P
CH3
O
H3C
N
O
N
CH3
CH3
V.1.3 © gsartor 2001-2008
Cinetica enzimatica
- 100 -
Inibitori irreversibili
Inibitore
Parathion
Formula
C2H5
O
O
P
S
N-tosil-Lfenilalanina
clorometil
chetone
(TPCK)
C2H5
NO2
Meccanismo
Come il DFP
Sintetico
O
(particolarmente attivo
su acetilcolinesterasi di
insetti)
O
Sintetico
Reagisce con l’His57 della
chimotripsina
Penicillum
Notatum
Inibisce gli enzimi
della sintesi della
parete batterica
Cl
HN
S
O
R
O
O
HN
S
Penicillina
O
V.1.3 © gsartor 2001-2008
Origine
N
CH3
CH3
CH3
Cinetica enzimatica
- 101 -
Attivatori
• Sono molecole che aumentano (o permettono) l’attività
enzimatica
– Protezione dell’enzima
• Glutatione
• Ioni metallici
– Attivazione per azione sulle subunità
Enzima inattivo + cAMP 
Subunità + Subunità
catalitica
regolatrice
– Azione proteolitica su proenzimi
V.1.3 © gsartor 2001-2008
Cinetica enzimatica
- 102 -
Attivatori
• Azione proteolitica su proenzimi
Tripsinogeno
+
Chimotripsinogeno
Enteropeptidasi
+
Tripsina
Proelastasi
p-chimotripsina
Procarbossipeptidasi
+
+
Elastasi
Carbossipeptidasi
V.1.3 © gsartor 2001-2008
Cinetica enzimatica
+
a-chimotripsina
- 103 -
Effetti allosterici
• Un enzima allosterico è, in genere,
un oligomero con subunità
correlate.
• Gli effetti allosterici consistono nel
legame di un effettore ad un sito
diverso da quello del substrato con
conseguente variazione delle
proprietà cinetiche dell’enzima.
• L’effettore può essere lo stesso
substrato (effettori omotropici) o
diverso (effettori eterotropici).
V.1.3 © gsartor 2001-2008
Cinetica enzimatica
Sito
attivo
Sito
dell’effettore
- 104 -
Effetto allosterico
• Un enzima allosterico è un
oligomero con subunità correlate la
cui attività (Km) viene influenzate
dal legame del substrato
V.1.3 © gsartor 2001-2008
Cinetica enzimatica
- 105 -
Effetti allosterici
• Il legame con l’effettore modifica (modula) le proprietà
di legame del substrato.
• La velocità dipende da [S] come una sigmoide.
(K + [S])n
v
v=
Vmax [S]n
n = indice di cooperatività
[S]
V.1.3 © gsartor 2001-2008
Emoglobina
Cinetica enzimatica
- 106 -
Vie metaboliche
• Una via metabolica è data da un insieme di reazioni
catalizzate da enzimi che si susseguono l’una all’altra.
• Le vie metaboliche sono regolate:
Inibizione da
prodotto
Attivazione da
substrato
V.1.3 © gsartor 2001-2008
A
A
B
B
C
C
Cinetica enzimatica
D
E
D
E
- 107 -
Vie metaboliche ramificate
Inibizione
multivalente A
Inibizione
cooperativa
V.1.3 © gsartor 2001-2008
A
B
C
B
Cinetica enzimatica
E
F
G
K
X
Y
D
C
E
F
G
K
X
Y
D
- 108 -
Vie metaboliche ramificate
Inibizione
cumulativa
Inibizione
di enzimi
multipli
V.1.3 © gsartor 2001-2008
A
A
B
B
C
C
Cinetica enzimatica
E
F
G
H
K
I
Z
X
Y
E
F
G
K
X
Y
D
D
- 109 -
Catabolismo e anabolismo
C
A
B
S
E
X
V.1.3 © gsartor 2001-2008
F
T
Z
Y
Cinetica enzimatica
- 110 -
Regolazione genica
• Un’altra via con la quale viene regolata l’attività di uno o più
enzimi è attraverso l’induzione o la repressione genica della
sintesi proteica di quella proteina con attività enzimatica.
• Anche per gli enzimi esiste una sorta di omeostasi.
ENZIMA
SINTESI
mRNA
DEMOLIZIONE
AMINOACIDI
Induzione
Repressione
DNA
V.1.3 © gsartor 2001-2008
Cinetica enzimatica
- 111 -
Fly UP