Isolamento dei virus respiratori

L’isolamento virale: aspetti
innovativi
A.Azzi
Firenze, 19/11/2004
LeLe
colture
cellulari
colture
cellulari
• Colture primarie
Colture primarie
• Linee continue
• In monostrato
• In sospensione
• Primo passaggio di
cellule ottenute dalla
disaggregazione di un
tessuto espiantato
• Rappresentative del
tessuto d’origine
• Laboriose da preparare
• Molto variabili
Le colture cellulari
• Colture primarie
• Linee continue Linee
continue
• In monostrato
• In sospensione
linee di cellule trasformate
e immortalizzate per
mutazione spontanea o
indotta da
• carcinogeni chimici
• radiazioni ionizzanti
• infezione in vitro con
agenti immortalizzanti.
Le colture cellulari
Linee subcontinue:
• possono essere subcoltivate per un
limitato numero di passaggi dopo la
coltura primaria, prime del fenomeno di
senescenza
• mantengono il fenotipo normale
Le colture cellulari
• Colture primarie
• Linee continue
• In monostrato
• In sospensione
Aderenti al supporto
Es HeLa, Hep-2, KB, MRC
5 WI38 ………..
Rene di coniglio
Fibroblasti di polmone umano
Hep-2
Fornitori di colture cellulari
• ATCC American Type Culture Collection
http://www.atcc.org
• ECACC European Collection of (Animal) Cell
Culture http://www.camr.org.uk/ecacc.htm/
• DSMZ Deutsche Sammlung vov
Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH
http://www.dsmz.de/
• Centro Substrati Cellulari-Istituto Zooprofilattico
di Brescia http:/www.bs.izs.it
I terreni per le colture cellulari
• Terreni di crescita
+ siero bovino fetale al
10 %
• Terreni di
mantenimento
+ siero bovino fetale al
2%
• Terreni serum-free
Principali componenti
Sol. salina bilanciata
Sistemi tampone (bicarbonato/CO2,
Hepes)
Carboidrati o glutamina
Aminoacidi
Vitamine
Ormoni e fattori di crescita
Proteine e peptidi
Acidi grassi e lipidi
Fattori accessori (tracce di elementi,
nucleotidi)
Antibiotici ???
La coltura tradizionale
•
•
•
•
•
•
•
Asportazione del terreno
Lavaggi
Inoculazione del campione (pre-trattato)
Adsorbimento (incubazione x 1 ora a 37°C)
Asportazione dell’inoculo
Aggiunta del terreno di mantenimento
Incubazione per giorni, fino a comparsa
dell’ECP
Identificazione del virus e tipizzazione
Limite dei sistemi tradizionali di
isolamento
• Esperienza
• Tempo
• Necessità di mantenere diverse linee
Shell vial
Inoculazione in shell vials
DEAFF test for CMV
(Virology Laboratory, Yale-New Haven Hospital)
Linee cellulari per l’isolamento di
virus
Alcune linee “particolari”
• HCE (human corneal epithelial): da coltura
primaria da donatore cornea cellule
immortalizzate con vettore ricombinante SV 40adenovirus
– per HSV-1
• Linea B95-8: linea linfoblastoide trasformata da
EBV
– Per virus del morbillo
Valutazione della linea
• Inoculazione campioni (corneal scraping)
in shell vials di HCE e Vero
• Incubazione 12-24 ore
• IF con sieri policlonalianti-HSV-1
• Valutazione qualitativa = presenza di
cellule con IF specifica
• Valutazione quantitativa = n° foci IF in
ciascun preparato (shell vial)
Risultato
• Vero: 4 pos /17
• HCE: 10 pos /17
HCE monostrato
HCE cells ECP
ECP in shell vial
IF su HCE infettate con HSV 1
Colture cellulari
• Transgenic cell lines for detection of
animal viruses
Olivo 1996
Espressione di recettori virali
• Characterisation of L cells expressing the
human poliovirus receptor for the specific
detection of poliovirus in vitro.
Pipkin et al 1993
• Cellule transgeniche che favoriscono
l’individuazione del virus
Rapid detection of HSV with an
enzyme-linked virus inducible
system (ELVIS) employng a
genetically modified cell line
Profitt and Schindler 1995
Isolamento dei virus respiratori
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•
Influenza A
Influenza B
Virus respiratorio sinciziale
V.parainfluenzale 1
V.parainfluenzale 2
V.parainfluenzale 3
Adenovirus
Isolamento di virus respiratori
Necessità di allestire colture con diverse linee cellulari
• Coltura tradizionale
•
Hep-2, LLC-MK2, MDCK su vetrino
Inoculazione
Centrifugation-enhanced
Centrifugazione shell
a 700 xvial
g culture
Incubazione per 16-24 ore e 40-48 ore
• Coltura simultanea di più linee cellulari
•
Hep-2, LLC-MK2, MDCK :sospensione mista
contenente 50.000 cellule di ciascuna linea /vetrino
R-Mix e R-Mix shell
vial
Inoculazione
Incubazione per 48 ore
IF con pool monoclonali
1
Coltura simultanea di più linee
cellulari
2
IF 7 diversi monoclonali: Flu A, Flu B, RSV, Para 1,Para 2, Para 3, Ad
R-MIX
• Shell vial: cellule di polmone di visone
(ceppo Mv1Lu) e cellule di
adenocarcinoma umano (A549)
• Inoculazione
• Centrifugazione (1 ora a 700x g)
• Incubazione per 24 ore - 48ore
IF
Isolamento dei virus respiratori
• La coltura tradizionale a tempi lunghi
rimane il test di riferimento
• IFD < CM < CT
• Monostrati di cellule criopreservati
– HELVIS
– R-mix
Stabili a -80°C per oltre 4 mesi