Lezione 1: Colture cellulari

Colture Cellulari
Introduzione
Colture cellulari in vitro: cellule isolate dal loro
ambiente e messe in condizioni di vivere all'interno di
un sistema definito
 strumento fondamentale per studi biochimici, microbiologici, farmacologici…
 utili nella produzione di fattori di crescita, anticorpi
monoclonali, vaccini, proteine ricombinanti in generale …
Introduzione
1951
messa in coltura della prima linea
cellulare stabilizzata umana, di origine
tumorale: la linea HeLa (dal nome della prima
paziente).
Conoscendo le caratteristiche delle colture è
possibile apprezzarne i vantaggi offerti (ad
esempio studi di tossicità sulla nostra specie,
per la quale in vivo esistono evidenti problemi).
Colture cellulari
Batteri
Lieviti (eucarioti inferiori)
Colture di cellule vegetali
Colture primarie di cellule animali
Linee cellulari
In sospensione
Adese
Cellule primarie animali: esempii
Linfociti/timociti
Macrofagi
Cellule di embrione di pollo/ratto
Cellule di fegato /cuore di embrione
Fibroblasti
Vantaggi nelle colture cellulari
Larga disponibilità di tipi di cellule
Disponibilità commerciale di media , fattori, ecc.
Documentazione su isolamento/conservazione
Controllo delle variabili ambientali (T, pH..)
Semplicità nel replicare esperimenti
Possibilità di dimensionare gli esperimenti con
finalità biotecnologiche
Riduzione nel numero di animali uccisi
Svantaggi nelle colture cellulari
Metodi molto specializzati e laboriosi
Costo dei materiali richiesti (ad esempio, siero,
fattori di crescita...)
Sistemi semplificati rispetto ad un organismo
integrato
Difficoltà di correlare le concentrazioni in vitro
con quelle in vivo
Tipi di colture cellulari
Colture a breve/lungo termine: nel primo caso il numero di cicli
cellulari cui vanno incontro le cellule è ridotto: in colture a lungo
termine le cellule si dividono molte volte, o addirittura illimitatamente (linee cellulari stabilizzate.)
Colture in monostrato/ in sospensione: generalmente le cellule
tendono ad aderire alla superficie del recipiente di coltura:
moltiplicandosi formano un monostrato, in quanto risentono
dell’inibizione da contatto. Cellule trasformate invece possono
formare pluristrati.
Colture clonali: le cellule vengono diluite prima della “semina” in
modo da avere ogni cellula separata, che prolifera formando una
singola colonia (clone).
Evoluzione di una linea cellulare in coltura
Tra la “semina” e la ripresa della
crescita c’è un intervallo. Il grafico
mostra l’evoluzione del logaritmo del
numero di cellule nel tempo.
La coltura primaria è caratterizzata
da un tempo di duplicazione lento, che
aumenta notevolmente nei successivi
passaggi in coltura, quando si parla di
linea cellulare primaria.
Nella terza fase si nota la
senescenza, con tempi di duplicazione progressivamente più lunghi
(sino alla morte), a meno che
(porzione arancione) non intervenga
una trasformazione, che produce una
linea cellulare immortalizzata in
grado di replicarsi indefinitamente.
Colture primarie
Prelievo delle cellule da un campione
(organo, embrioni o uova).
dissezione meccanica.
Trattamento con tripsina (o altro
enzima) per eliminare i contatti tra
cellule.
Inibitore per
enzimatica
bloccare
Controllo della vitalità
esempio trypan blue)
la
digestione
cellulare
(ad
Le colture cellulari possono essere
seminate su terreno solido in piastra
Petri oppure in sospensione.
Coltura primaria
Le cellule derivano direttamente dal tessuto d’origine,
mantenendo molte caratteristiche funzionali riscontrabili in
vivo.
Durante la crescita avviene una selezione in base al
grado di proliferazione: aumentano cellule attivamente
proliferanti, restano stazionarie quelle in grado di
sopravvivere ma non di duplicarsi, mentre altri tipi di
cellule sono incapaci di resistere.
Questo comporta un’evoluzione nel tempo delle
proporzioni dei diversi tipi cellulari, fino a giungere ad un
equilibrio notevolmente diverso dalla situazione di
partenza.
Quando la proliferazione ha depauperato il mezzo di
coltura, occorre provvedere ad una sub-coltura in un
nuovo recipiente con terreno fresco
Linee cellulari
Linee cellulari a vita finita –Resistono in coltura un numero limitato
di cicli cellulari; crescono in monostrato risentendo dell’inibizione da
contatto; fortemente dipendenti da fattori di crescita presenti nel
siero.
Linee cellulari continue (trasformate) – hanno origine da
mutazioni (spontanee o indotte con agenti chimici, fisici o biologici) a
partire da colture primarie o da linee cellulari a vita finita; possono
essere ottenute da tumori. Presentano minore dipendenza da fattori
del siero e minore inibizione da contatto.
Linee cellulari clonali – sono linee cellulari derivanti da una singola
cellula; servono per ottenere una popolazione il più possibile
omogenea
Trasformazione di una linea cellulare
Il processo della trasformazione rende immortale una
linea cellulare.
ll processo ha inizio con l’acquisizione da parte della
linea cellulare della capacità di proliferare indefinitamente (immortalizzazione);
richiede un certo
numero di mutazioni in geni diversi.
Quando avviene (anche spontaneamente) in coltura, si
osservano al microscopio dei foci di trasformazione,
ovvero delle masserelle di cellule simili a quelle
tumorali, che non risentono della inibizione da contatto.
Il laboratorio per le colture cellulari
cappa
centrifuga
incubatore
Contaminazioni delle colture
L’ingresso indesiderato di microorganismi nel terreno di coltura è
dannoso, in quanto questi competono con le cellule in coltura (che
generalmente hanno ritmo di crescita inferiore) e possono
secernere sostanze tossiche. Tipici contaminanti sono batteri,
micoplasmi, lieviti, muffe.
In caso di infezione batterica il terreno vira in fretta (acidifica) e
intorbidisce. Le infezioni da micoplasmi sono più subdole, in
quanto il microrganismo è meno visibile e richiede un paio di
settimane per formare colonie visibili.
Questo pericolo determina la prassi di aggiungere antibiotici al
terreno (ad esempio: streptomicina-penicillina); va ricordato che
sono stabili per pochi giorni a 37°C.
Sterilità
Al fine di mantenere la sterilità per la coltura
cellulare, il laboratorio di biologia cellulare
deve essere esclusivo: occorre lavorare sotto
cappe a flusso laminare, alle quali vanno
sostituiti periodicamente i filtri.
Per la sterilizzazione dei materiali:
 Stufa a secco, 150°C per 3 ore → per la vetreria
 Autoclave (calore umido), 1 atm, 121°C → per
filtri, soluzioni saline…
 Filtrazione con filtri da 0.22 μm → terreni di
coltura, soluzioni organiche…
 Raggi γ → materiali di plastica
Piastre di coltura
Piastre Petri
Fiasca con tappo ventilato
Superficie: 25-235 cm2
Piastre multipozzetto
(multiwell) (6-384 pozzetti)
Il mezzo extracellulare
Fase gassosa, Temperatura, Substrato di
adesione e terreno di coltura
Le cellule di mammifero crescono a 37°C, sature
di umidità, in un mezzo tamponato a pH ~7.3. Il
sistema tampone più comunemente utilizzato è
bicarbonato/acido carbonico
Il pH viene monitorato aggiungendo un indicatore
come il rosso fenolo (giallo a pH acido, rossoviola a pH alti).
Composizione di un terreno per cellule
animali
Amminoacidi
Vitamine
Sali
Glucosio
Antibiotici
Indicatore
Siero
Terreni di coltura
La composizione dei mezzi di coltura prevede:
Sali inorganici (Na+, K+, Mg++, Ca++, Cl-,..)
Glucosio, glutammina
Aminoacidi essenziali
Vitamine del gruppo B
Tracce di Fe, Zn, Cu, Se, Mn, Mo (tracce significa
che non occorre aggiungerli in quanto le minime
contaminazioni presenti in altri componenti sono
sufficienti).
 Siero fetale bovino, 5-20% o un sostituto





Il siero
L’uso del siero è controverso. Generalmente si preferisce il siero fetale in
quanto contiene meno anticorpi.
Vantaggi
Protegge le membrane
grazie al corretto grado
di viscosità;
Introduce fattori di
crescita ed ormoni;
Veicola lipidi, ferro e
molecole organiche;
Favorisce interazione
cellule-substrato;
Contiene inibitori della
tripsina
Svantaggi
Possibile tossicità degli
anticorpi;
Variabilità da lotto a lotto;
Inibitori metabolici;
Fattori di crescita che
favoriscono i fibroblasti
rispetto ad altri tipi cellulari
Terreni definiti
L’uso di terreni privi di siero nasce al desiderio di avere condizioni
controllate, riproducibili e specifiche per il tipo cellulare in esame.
Devono contenere: un inibitore della tripsina, fattori di adesione, ormoni,
fattori di crescita, nutrienti e proteine.
Vantaggi
Maggiore riproducibilità;
Standardizzazione
anche fra laboratori
diversi;
Può favorire
subpopolazioni
specifiche (non solo
fibroblasti);
Agevola la purificazione
di un prodotto;
Svantaggi
 Cellule più sensibili alle
condizioni ambientali;
 Crescita più lenta;
 Alcuni additivi sono
costosi e/o labili;
 I terreni sono specifici
per un tipo cellulare;
La cappa
Campi d’applicazione
Esempi d’indagine
Ambito
Controllo della crescita e del metabolismo, analisi del
differenziamento. Ingegneria tissutale (coltura e
produzione in vitro di porzioni di tessuto).
Studio di promotori e enhancers, di espressione genica e di
interi genomi.
Biologia cellulare
Analisi di mutanti. Mappaggio, trasfezione con DNA
esogeno.
Genetica
Diagnosi cliniche (anche prenatali)
Citogenetica
Caratterizzazione di tumori.
Oncologia
Test di citotossicità.
Farmacologia
Produzione di proteine ricombinanti (ormoni…) e di
anticorpi monoclonali.
Immunologia
Biologia molecolare