Neurobiologia applicata

ATTIVITÀ INTRACELLULARE
GENETICA
INTERAZIONE AMBIENTALE
INTERAZIONE CELLULA-CELLULA
Colture cellulari
• Colture di cellule vegetali
• Colture primarie di cellule animali
• Linee cellulari
• In sospensione
• Adese
DI TESSUTO
PRIMARIE
COLTURE
LINEE A BREVE
TERMINE
LINEE
CELLULARI
CONTINUE
Non
Tumorali
Tumorali
LINEE INGEGNERIZZATE
COLTURE CELLULARI:
Coltura primaria: una coltura iniziata da un espianto di
cellule, tessuti od organi prelevati da un organismo.
Una coltura si definisce primaria sino alla sua prima
subcoltura:a questo punto diventa linea cellulare primaria.
Subcoltura: raccolta di cellule da una coltura e loro
utilizzo per dare inizio ad una nuova coltura. Questo
termine è sinonimo di passaggio.
Linea cellulare: una coltura cellulare che emerge da un
espianto primario dopo la prima sub-coltura. la linea
cellulare implica che le colture che ne derivano siano
costituite da cellule originariamente presenti nella coltura
primaria.
Evoluzione di una linea cellulare in
coltura
Tra la “semina” e la ripresa della
crescita c’è un intervallo. Il grafico
mostra l’evoluzione del logaritmo
del numero di cellule nel tempo.
La
coltura
primaria
è
caratterizzata da un tempo di
duplicazione lento, che aumenta
notevolmente
nei
successivi
passaggi in coltura, quando si
parla di linea cellulare primaria.
Nella terza fase si nota la
senescenza, con tempi di duplicazione progressivamente più
lunghi (sino alla morte), a meno
che (porzione arancione) non
intervenga una trasformazione, a
produrre una linea cellulare
immortalizzata, in grado di
replicarsi indefinitamente.
Linea cellulare continua: una popolazione di
cellule che può essere propagata per un numero
infinito di passaggi.
Linea cellulare finita: una coltura di cellule in
grado di proliferare per un numero limitato di
volte dopo le quali cessa di proliferare.
Il laboratorio di Biologia cellulare
cappa
centrifuga
Alcune norme pratiche:
• Il laboratorio di colture cellulari deve essere
usato esclusivamente a questo scopo
• Usare esclusivamente cappe a flusso
laminare sterile
• Tutto il materiale utilizzato deve essere
sterile
• Utilizzare unicamente il pipettatore
automatico
incubatore
Cappa a flusso laminare
• Flusso laminare: flusso unidirezionale formato da
filetti di aria sterile, filtrata attraverso filtri HEPA,
paralleli tra loro ed aventi tutti la stessa velocità,
generalmente di 0,5 m/sec. I filetti di aria sterile
trascinano lontano dall’area di lavoro i contaminanti
ed evitano la formazioni di vortici.
• Filtri HEPA(High Efficiency Particulate Air):
prevengono la contaminazione particellare, sono
costituiti da fogli di microfibre di vetro ripiegati più
volte per aumentare la superficie filtrante;
l’efficienza è la capacità di trattenere particelle di 0,3
micron di diametro e deve essere compresa tra
99,97% e 99,99%.
• Le cappe a flusso laminare garantiscono
principalmente la protezione del campione da
contaminazioni non la protezione dell’operatore e
dell’ambiente
Cappa a flusso laminare
●Cappe biologiche di classe II: maggiormente impiegate
in laboratori di ricerca e microbiologici, sono anche
definite cappe di sicurezza microbiologica
●Cappe biologiche di classe III: caratterizzate da una
chiusura totale ermetica, funzionano a pressione
negativa; le manipolazioni all’interno della camera
sono consentite da due o più guanti di gomma
incorporati nella struttura della cappa.
I campioni, in contenitori chiusi, sono introdotti tramite
un sistema di doppi sportelli. Hanno un filtro HEPA
sull’aria in ingresso ed un doppio filtro HEPA sull’aria
in uscita
-Protezione totale dell’operatore e dell’ambiente.
-Manipolazioni ad alto rischio biologico
Per quanto riguarda le cappe biologiche di
classe II si devono osservare queste norme:
• Il piano di lavoro deve essere pulito in
successione con acqua distillata e alcool
denaturato all’inizio e alla fine di
ogni manipolazione
• Si deve aver cura di non lasciare macchie di
terreno e siero sul piano di lavoro
• Controllare periodicamente la cappa
cambiando i filtri assoluti in base alle ore di
utilizzo ( circa 5000)
Un test pratico per verificare la sterilità del
flusso laminare nella cappa consiste nel
lasciare una capsula di Petri aperta con terreno
per colture batteriche sotto cappa per 3-4 ore e
quindi incubarla a 37°C per verificare eventuali
Contaminazioni (….LOGICAMENTE non
nell’incubatore delle colture cellulari)
Perché si utilizzano gli incubatori?
Il sistema tampone utilizzato nei terreni è il HCO3/CO2.
Per questo motivo devono essere coltivate in atmosfera al 5% di CO2 e
necessitano quindi di incubatori con sistema di controllo
dall’atmosfera.
Contaminazioni delle colture
• L’ingresso indesiderato di microorganismi nel terreno di
coltura è dannoso, in quanto questi competono con le
cellule in coltura (che generalmente hanno ritmo di
crescita inferiore) e possono secernere sostanze
tossiche. Tipici contaminanti sono batteri, micoplasmi,
lieviti, muffe.
• In caso di infezione batterica il terreno vira in fretta
(acidifica) e intorbidisce.
• Questo pericolo determina la prassi di aggiungere
antibiotici al terreno (ad esempio: streptomicinapenicillina); va ricordato che sono stabili per pochi giorni
a 37°C.
Sterilità
• Al fine di mantenere la sterilità per la
coltura cellulare occorre lavorare sotto
cappe a flusso laminare, alle quali
vanno sostituiti periodicamente i filtri.
• Per la sterilizzazione dei materiali:
– Stufa a secco, 150°C per 3 ore  per la
vetreria
– Autoclave (calore umido), 1 atm, 121°C
 per filtri, soluzioni saline…
• Filtrazione con filtri da 0.22 μm 
terreni di coltura, soluzioni organiche…
Precauzioni per la prevenzione delle
contaminazioni
•Sterilità soluzioni e terreni utilizzati
•Contaminazioni batteriche antibiotici
•Contaminazioni miceti anfotericina B
(2,5µg/ml) sono a volte tossici per le
cellule
•Materiale monouso sterile
•Non esistono sistemi di prevenzione per
infezioni virali o micoplasma
•Non utilizzare l’animale nella cappa
sterile in quanto portatore di
contaminazione
Piastre di coltura
Piastre Petri
Fiasca con tappo ventilato
Superficie: 25-235 cm2
Piastre multipozzetto
(multiwell) (6-384 pozzetti)
Prevenzione: corretto uso della
cappa biologiaca
•
•
•
•
•
•
Separare sezione di lavoro da sezione di scarto.
Non posizionare materiale sui bordi
Evitare movimenti che alterino il flusso laminare
Non parlare mentre si è sotto cappa non posizionare oggetti tra l’origine del
flusso ed altro materiale (colture)
Disinfettare tutto ciò che entra nella cappa
Non sovraccaricare la cappa
Antibiotici sempre?
• Vengono utilizzati generalmente a scopo preventivo per evitare
contaminazioni batteriche.
• Di norma si utilizzano penicillina e streptomicina in alcuni casi viene
utilizzata anfotericina B come antimicotico
• Si può lavorare anche senza, non sono necessari per la crescita cellulare
• Un possibile inconveniente all’uso sistematico degli antibiotici è lo sviluppo
ceppi resistenti agli antibiotici usati con notevole danno alle colture.
Micoplasmi
Prevenzione, rilevazione e rimozione
• I micoplasmi sono piccoli batteri(<1um) che
mancano della parete cellulare. Alcuni sono
patogeni in umani e animali. Poiché mancano
della parete cellulare, sono immuni alla maggior
parte degli antibiotici più comuni che agiscono
sulla sintesi della parete. Inoltre possono
passare i filtri sterilizzanti (0,2um).
• Molte specie di Micoplasma possono infettare le
colture cellulari. Molto spesso sono dovute
all’operatore o alla presenza di elementi
contaminanti nel tereno di coltura
Prevenzione
La contaminazione di incubatori, bagni e banchi di lavoro sterili è spesso
un problema molto serio, che può portare a danni molto steri
Diversi prodotti presenti sul mercato:
1-SOLUZIONI PER DISINFETTARE INCUBATORI CO2
2-SOLUZIONI DISINFETTANTI PER BAGNI ED ACQUA
3-SOLUZIONE DISINFETTANTE SPRAY PER LA PULIZIA
(COMPOSTI QUATERNARI DEL BENZIL AMMONIO)
RIVELAZIONE
Perché fare un test per verificare la presenza di micoplasma?
•Le colture cellulari offrono condizioni di vita ideali per il micoplasma:
La contaminazione è sempre possibile.
•Anche in presenza di un forte inquinamento non si osserva alcuna
torbidità del terreno e non vi sono elementi visibili che indicano la
presenza di un inquinamento.
•Tuttavia le funzioni cellulari vengono influenzate e i risultati sperimentali
possono essere interpretati in modo errato.
Panoramica dei metodi esistenti
Metodo
Dispositivi necessari/ valutazione
Metodo con sonde
fluorescenti
Microscopio a fluorescenza/ veloce poco costoso, poco sensibile
Metodi biochimici
Nessuno/ richiede indicatori, bassa sensibilità, facile
Metodi con kit
immunoenzimatici
Lettore Elisa/ specifici per specie distinte, media sensibilità
Metodi con PCR
Termociclatore, sistema per elettroforesi sistema di acquisizione/ alta
sensibilità, specie e tipo specifico
Quando eseguire un test?
• Tutte le volte che nuove colture di cellule
entrano in laboratorio
• Almeno ogni 3 mesi
• Prima di ogni conservazione in azoto
liquido
• A seguito di modifiche delle caratteristiche
cellulari
• In caso di problemi di riproducibilità degli
esperimenti
In caso di contaminazione
• Immediata quarantena (o eliminazione) e
verifica di tutte le colture crioconservate o
dei campioni derivati
• Informare tutti coloro che possono aver
ricevuto materiale a contatto con la coltura
contaminata
• Disinfezione standard del laboratorio
• Iniziare trattamento contro il micoplasma
in caso di cellule “non sostituibili”
Trattamento delle colture
contaminate
• Antibiotici: fluoroquinolone o BM-cicline o altre
tetracicline
• Metodi fisici e chimici es Foto inattivazione con
Hoechst 3325875-Bromuracil,
Media Type
Examples
Use
Balanced salt
solutions
PBS, Hanks’BBS, Earle’s salts
DPBS
HBSS
EBSS
Form the basis of many complex
media
Basal media
MEM Minimum essential Medium
PRIMARY CULTURE
DMEM Dulbecco’s modification of Mem
Modification of Mem containing
increased level of amino acids and
vitamins.
Glagows modified MEM was
defined for BHK-21 cells
GMEM
Complex media
RPMI 1640 Roswell Park Memorial
Institute
Leibovits L-15
Serum free media
DMEM/F12
Neurobasal
Originally derived for human
leukaemic cells. It support a wide
range of mammalian cells.
Designed for CO2 free
environments
These media must be
supplemented with other factors
such as insulin, transferrin and
epidermal growth factor.
Costituenti base dei
terreni
Sali inorganici
Carboidrati
Aminoacidi
Vitamine
Acidi grassi e lipidi
Proteine e lipidi
Siero
Sali inorganici
• Mantengono l’equilibrio osmotico
• Aiutano a mantenere il potenziale di
membrana
• Sono richiesti dalla matrice extracellulare
per l’adesione cellulare
• Sono cofattori enzimatici
Sistemi tampone
• Sistema bicarbonato è un sistema naturale e richiede
un’atmosfera controllata 5-10% CO2
• Hepes: è una molecola sintetica non tossica con forte potere
tamponante, si utilizza di solito alla concentrazione di 20mM.
L’Hepes non richiede un’atmosfera controllata, ma ha
l’inconveniente di essere caro e di non essere gradito da tutte
le cellule. Utile quando si manipolano le cellule per lunghi
tempi fuori dall’incubatore. La CO2 dell’atmosfera non è
sufficiente mantenere il PH neutro per cui il terreno si
alcalinizza con conseguente danno delle cellule.
• Molti media contengono il rosso fenolo un indicatore di pH
Indicatore con colore rosso-arancio a PH 7,3 vira al giallo a PH
acido ( 6,8-7,0) e vira al rosso-viola a PH alcalino (>7,6)
Carboidrati
• Glucosio e galattosio
• Maltosio e Fruttosio
• Concentrazione 1g/l- 4,5g/l
Aminoacidi
Gli aa essenziali devono essere aggiunti al terreno di crescita
Le quantità da aggiungere variano dal tipo cellulare con cui si sta
lavorando.
La glutammina è l’AA essenziale più usato nelle colture cellulari.
Questo AA è labile pertanto se il terreno
viene conservato a 4°C per tempi più lunghi di 15 giorni è
necessario riaggiungere glutamina al terreno al momento
dell’uso
Vitamine
• Le vitamine comunemente contenute nei terreni sono la
riboflavina , la tiamina e la biotina. (siero)
• Il siero è una fonte di vitamine, per le colture che crescono in
terreno serum free è necessario aggiungerele.
Proteine e peptidi
• Le vitamine comunemente contenute nei terreni sono
l’albumina, transferrina, fibronectina. (siero)
Siero
• Il siero contiene albumina, fattori di crescita ed
inibitori della crescita.
• Il siero più comunemente usato è il Foetalbovin
serum (FBS)
• La qualità, il tipo e la concentrazione di siero
possono interferire notevolmente sulla crescita
cellulare
• Il siero aumenta la capacità tamponante del terreno
• Protegge le cellule dal danno meccanico
• Il siero può legare e neutralizzare le tossine
• Possono verificarsi contaminazioni associate all’uso
del siero
Il siero
Vantaggi
• Protegge le
membrane grazie al
corretto grado di
viscosità;
• Introduce fattori di
crescita ed ormoni;
• Veicola lipidi, ferro e
molecole organiche;
• Favorisce
interazione cellulesubstrato;
• Contiene inibitori
della tripsina
• Svantaggi
• Possibile tossicità degli
anticorpi;
• Variabilità da lotto a
lotto;
• Inibitori metabolici;
• Fattori di crescita che
favoriscono i fibroblasti
rispetto ad altri tipi
cellulari
Coltura primaria
• Le cellule derivano direttamente dal tessuto
d’origine, mantenendo molte caratteristiche
funzionali riscontrabili in vivo.
• Durante la crescita avviene una selezione
in base al grado di proliferazione:
aumentano cellule attivamente proliferanti,
restano stazionarie quelle in grado di
sopravvivere, ma non di duplicarsi, mentre
altri tipi di cellule sono incapaci di resistere.
ES. colture neuronali e astrocitarie
Colture primarie
• Prelievo delle cellule da
campione (organo, embrioni).
un
• dissezione meccanica.
• Trattamento con tripsina (o altro
enzima) per eliminare i contatti
tra cellule.
• Inibitore per bloccare la digestione
enzimatica
• Controllo della vitalità cellulare (ad
esempio trypan blue)
• Le colture cellulari possono
essere seminate in piastra Petri
oppure in sospensione.
Colture primarie
Norme generali:
• Grasso e tessuto necrotico devono essere eliminati
Questa operazione va effettuata con strumenti adatti
per causare il minimo danno e preferibilmente sotto
stereomicroscopio.
• Gli enzimi utilizzati per la disgregazione devono
essere inibiti ed eliminati con una centrifugazione
delicata
• La concentrazione di cellule nella cultura primaria
dovrebbe essere più alta di quella che poi utilizzeremo
nella subcultura
• Utilizzare dove possibile un medium ricco Es
DMEM/F12
• Tessuto embrionale è da preferirsi ( più facilità nella
disgregazione, più cellule vitali,proliferazione più
rapida nella cultura primaria rispetto al tessuto adulto)
Colture primarie
LA DISSEZIONE
Grasso e tessuto necrotico devono essere
eliminati
Questa operazione va effettuata con
strumenti adatti per causare il minimo
danno e preferibilmente sotto
stereomicroscopio.
Colture primarie
Disgregazione enzimatica
Generalmente i protocolli di isolamento
prevedono una prima fase il cui scopo è
quello di separare i diversi tipi cellulari
presenti nel tessuto demolendo la matrice
extracellulare e le giunzioni intercellulari
che le mantengono unite.
A tale scopo il tessuto viene incubato con
enzimi proteolitici (tripsina e/o collagenasi)
dissociando le singole cellule mediante
tecniche meccaniche.
Gli enzimi utilizzati per la disgregazione
devono essere inibiti ed eliminati con una
delicata centrifugazione
Alla fase di dissociazione segue la fase di separazione dei vari tipi cellulari
da una sospensione cellulare mista
Si può procedere in vari modi:
1. Separando le cellule in base alle loro dimensioni o al loro peso,
centrifugandole a bassa velocità con l’ausilio di sostanze (es
Percoll, Ficoll o Lymphoprep) che creano gradienti a diversa
densità;
2. Sfruttando la diversa attitudine dei diversi tipi cellulari ad aderire
su superfici di vetro o di plastica;
3. Marcando le cellule con anticorpi coniugati con sostanze
fluorescenti, e separando le cellule marcate da quelle non marcate;
4. Utilizzando terreni di coltura selettivi che favoriscano la crescita
solo di alcuni tipi cellulari e/o aggiungendo al terreno di coltura
ormoni che favoriscono (o inibiscono) la crescita di determinati tipi
cellulari.
La sospensione cellulare omogenea così ottenuta è messa in
“coltura”, cioè viene trasferita in contenitori appositi contenenti
miscele di sostanze inorganiche ed organiche necessarie al
sostentamento delle cellule.
Le cellule crescono adese o in sospensione.
Le cellule adese crescono aderendo al supporto su cui sono
state seminate (cioè sulla parete della fiasca) crescono formando
monostrati (se sono sane, in quanto risentono dell’inibizione da
contatto) o pluristrati (se sono tumorali e quindi non risentono
dell’inibizione da contatto).
Le cellule in sospensione sono cellule che non crescono adese
alla parete della fiasca, ma sospese nel terreno di coltura senza
aderire ad alcun supporto.
Trasformazione di una linea
cellulare
• Il processo della trasformazione rende
immortale una linea cellulare.
• ll processo ha inizio con l’acquisizione da parte
della linea cellulare della capacità di proliferare
indefinitamente (immortalizzazione); richiede
un certo numero di mutazioni in geni diversi.
• Quando avviene (anche spontaneamente) in
coltura, si osservano al microscopio dei foci di
trasformazione, ovvero delle clusters di cellule
simili a quelle tumorali, che non risentono della
inibizione da contatto.
Dove trovare le linee cellulari
• Produzione in laboratorio
• Banche cellule
– European Collection of Cell Culture
www.ecacc.org.uk
– AmericanTissueCultureCentre
(USA)
www.atcc.org
– National Cell Culture Center (USA)
www.nccc.com
– German Collection of Microorganism
and Cell Culture
www.dsmz.de
– IZS Centro Substrati Cellulari
www.bs.izs.it
– IST Servizio Biotecnologie
www.biotech.ist.unige.it
PROTOCOLLO PER LA PROPAGAZIONE DI UNA COLTURA CELLULARE
Protocollo per le subcolture
Da una fiasca contenente cellule a confluenza:
•Scartare il terreno di coltura;
•Lavare con terreno senza siero o PBS;
•Aggiungere tripsina;
•Lasciar agire la tripsina per circa 5-10 min a 37°C;
•In questo tempo preparare un tubo contenente terreno + FBS al 10%;
•Trascorsi i 5 minuti, verificare che le cellule si siano staccate; quindi aggiungere il
DMEM + FBS al 10% e centrifugare (10 min a 500xg);
•Scartare il sopranatante (sul fondo del tubo è visibile il pellet, composto dalle
cellule sedimentate);
•Aggiungere al sedimento una piccola quantità (circa 1 ml) di DMEM + FBS al 10%
per effettuare una risospensione graduale delle cellule; aggiungere altro DMEM +
FBS al 10% fino a raggiungere il volume desiderato.
•Prelevare un certo volume di sospensione cellulare e seminare in fiasca; il volume
di sospensione cellulare da seminare dipende dalla superficie di crescita della
fiasca e dalla densità desiderata.
La conta cellulare
• La conta cellulare è importante per
monitorare la crescita cellulare (curva di
crescita) in vitro e per seminare le cellule
nella corretta densità.
La conta cellulare
• Un metodo semplice ed economico è l’uso dell’emocitometro
• L’ emocitometro : consistente in un vetrino portaoggetti recante al
centro una depressione in cui è incisa una minutissima quadrettatura.
L’emocitometro serve per determinare il
numero di cellule per unità di volume di
un liquido.
Le cellule sono visivamente contate
per mezzo di un microscopio ottico.
Il solco centrale (camera principale) ha due set di reticoli incisi per il
conteggio,separati da un canale.
La camera principale nel canale centrale è più bassa di 0,1 mm (profondità della
camera), rispetto agli altri due canali esterni. Per cui, quando un vetrino
coprioggetto è posto sopra, c’è una differenza di 0,1 mm tra il vetro e la camera
centrale.
Burker
Neubauer
Thoma
IL RETICOLO DELLA CAMERA DI BURKER
Nell'area di 9mm² nello spessore della camera di Burker è
disegnato un reticolo ed è all‘interno di questo che verranno
contate le cellule sfruttando un riferimento spaziale preciso.
Lo spessore compreso fra il vetrino copri oggetto e la camera
contacellule è pari a 1/10 di mm (0,1mm) .
Per cui il volume sarà
1/10 di mm³ = 0,1 mm³ =10-1 mm³
Il reticolo della camera di Burker è fondamentalmente
strutturato in nove quadrati delimitati da tre righe
parallele con all'interno quadrati e rettangoli delimitati da
due righe parallele.
V = 0,1mm3
Una volta riempito per capillarità il sottile spazio fra
coprioggetto e camera, potrò contare le cellule
riconoscendole come sfere più o meno rifrangenti a seconda
del variare della regolazione del fuoco del microscopio. In
teoria potrei limitarmi a contare le cellule in uno solo dei 9
quadrati grandi, moltiplicarne il numero per 10 (porto al mm³)
e poi moltiplicare per il fattore di diluizione.
Ma la distribuzione delle cellule
può non essere perfettamente
omogenea
quindi...
...è consigliabile contare le cellule in 4 quadrati e calcolare la
media: in questo modo si riduce il margine di errore.
21 x 104
cellule per ml
In sintesi il sistema per contare le
cellule all'interno del reticolo della
camera di Burker prevede:
1) contare le cellule nei 4 quadrati
grandi disposti a Y (ricordandosi di
non considerare quelli all'interno
delle 3 righe di confine su due soli
lati): esempio 84
2) calcolare la media:
esempio 84:4=21
3) 21 in 0,1mm3
4) Moltiplicando per 104 ottengo il
numero di cellule in un cm3
1 cm3 = 1ml
...se le cellule sono state risospese in 5ml di terreno quante
cellule avrò in totale?
21 x 104 cellule : 1 ml = X : 5ml
X= 21 x 104 cellule / ml X 5ml
= 105 x 104 cellule totali
Conta vitale delle cellule:
Test di esclusione del colorante Trypan Blue
Il metodo del trypan blue permette di verificare la funzionalità e
la permeabilità della membrana plasmatica in quanto questo
colorante non attraversa la membrane delle cellule vitali,
mentre attraversa quella delle cellule danneggiate colorando il
citoplasma di blu.
Le cellule colorate in blu possono essere distinte e contate per
mezzo di una camera di conta al microscopio. I risultati
saranno espressi come percentuale di cellule vive
Si impiega in genere una soluzione allo 0,1%- 0,2% di Trypan
Blue in soluzione fisiologica, con l’accorgimento di diluire la
sospensione delle cellule con tale soluzione in rapporti fissi
(1:1 o 1:2)
Conta vitale delle cellule:
Test di esclusione del colorante Trypan Blue
Supponiamo di contare
25 cellule e che 4 di
queste cellule
presentino il typan blue
nel citoplasma, le cellule
vive saranno: 21 x 104,
mentre le cellule morte
saranno 4 x 104
Se abbiamo diluito delle
cellule con un rapporto
1:1
21 x 104 x 2
4 x 104 x 2
Fattore di diluizione
Conta vitale delle cellule:
Test di esclusione del colorante Trypan Blue
Se abbiamo diluito delle
cellule con un rapporto 1:1
21 x 104 x 2 / ml
4 x 104 x 2 / ml
vitalità cellulare (V)= N° di cell. vive/N° di cell. vive + N° di cell. Morte
= 21x104 / 21x104 + 4x104
= 0,84x 100
= 84%
La camera di NEUBAUER
Il modello più utilizzato ed attuale
La profondità della camera è di 0,1 mm.
Il reticolo mostra 9 larghi quadrati ciascuno
di 1 mm2.
I 4 larghi quadrati agli angoli (indicati da
una "L") sono suddivisi in altri 16 quadrati,
con lati da 0,25 mm.
Il largo quadrato centrale è suddiviso in 25
quadrati con lati da 0,2 mm. Ogni gruppo
di quadrati contiene 16 mini quadrati con
lati da 0,5 mm ognuno con un area di
0,0025 mm2.
L
L
L
L
Conta Cellulare con NEUBAUER (0.100 mm)
Diversamente dalla classica conta in camera
di Burker, la camera NEUBAUER si propone
di ottimizzare i tempi della conta infatti, vista al
microscopio ottico, essa è formata da soli 4
quadrati grandi delimitati da linee triple,
ognuno dei quali formato da ulteriori 16
quadrati più piccoli.
Noi andremo a contare le cellule contenute nei
4 quadrati grandi più quelle presenti su due lati
contigui di ogni quadrato (nella figura sono
segnati in rosso; la scelta dei lati contigui è
SOGGETTIVA).
Effettuata la conta come sopra descritto, il numero di cellule per ml e il
totale di cellule si ottiene secondo le seguenti formule:
- cellule/ml= A+B+C+D/4 x 10^4** x 2
- celluleTOT= cellule/ml x Volume Finale
CRIOCONSERVAZIONE
• Riduce il rischio di contaminazioni
microbiche.
• Riduce il rischio di deriva genetica e di
cambiamenti morfologici
• Permette di avere a disposizione una
batteria di cellule allo stesso numero di
passaggi
• Riduce i costi
CRIOCONSERVAZIONE
1.
2.
3.
4.
5.
Nome della linea cellulare
Provenienza
Posizione nel contenitore di azoto liquido
Data di congelamento
Numero di ampolle congelate
CRIOCONSERVAZIONE
1. Le cellule vengono congelate durante la
fase logaritmica o appena raggiunta la
confluenza
2. Le cellule devo essere congelate in
presenza di terreno di crescita e agenti
crioprotettivi come il DMSO o il glicerolo
che prevengono la formazione di cristalli
di ghiaccio durante l’abbassamento della
temperatura.
CRIOCONSERVAZIONE
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Protocollo
Crescere le cellule per il congelamento in numero sufficiente da poter
congelare (2-5 milioni di cellule per ampolla
Lavare ogni piastra con una quantità di sufficiente di PBS a coprire l’intera
superficie
Staccare le cellule con tripsina
Effettuere una conta vitale
Centrifugare le cellule 10 min a 500g
Risospendere le cellule con terreno per il congelamento 2-5 milioni per ml
(durante questa operazione le cellule devo essere messe in ghiaccio)
Aliquotare 1 ml in agni ampolla
Chiudere accuratamente i tappi
Marcare le ampolle con pennarelli indelebili
Sistemere le ampolleavvolte in cotone in una piccola scatola di polistirolo
porre il tutto in un congelatore a -80°C per almeni 10-15 ore
Trasferire le cellule nel contenitore dell’azoto
CRIOCONSERVAZIONE
Terreni di congelamento
• 90% Siero, 10% DMSO
• 90% di Terreno con siero al 50%, 10%DMSO
Nuova linea cellulare
Quarantena
Test
micoplasma
+
Abbandonare
il
congelamento
Principale camera di coltura
Espansione della coltura
Crioconservazione
10-100 vials
Conta cellulare/ vitalità
Test micoplasma
Caratterizzazione
Congelamento
Non riuscito
Ripetere il banking