Prodotti Elucigene® Male Factor Infertility Istruzioni per l`uso

Prodotti Elucigene® Male Factor Infertility Istruzioni per l'uso
Prodotti Elucigene® Male Factor Infertility
Istruzioni per l'uso
Prodotto
Elucigene Male Factor Infertility
Elucigene MFI-Yplus
Quantità
25 test
10 test
Codice catalogo
AZFXYB1
AZFPLBX
Per uso diagnostico in vitro
Prodotto da:
Elucigene Diagnostics
Citylabs
Nelson Street
Manchester
M13 9NQ
Vendita, assistenza clienti e assistenza tecnica:
Tel.: +44 (0) 161 669 8122
Fax: +44 (0) 161 669 8129
E-mail: [email protected]
E-mail: [email protected]
Elucigene Diagnostics è il nome commerciale di Delta Diagnostics (UK) Limited., una società iscritta in Inghilterra
e in Galles al numero di registrazione 8696299.
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Elucigene Male Factor Infertility
La gamma di prodotti Elucigene Male Factor Infertility comprende test multiplex del DNA per la rapida
determinazione dello stato di aneuploidia per i cromosomi sessuali e l'identificazione e la
caratterizzazione delle tre classi più comuni della microdelezione del cromosoma Y associate
all'infertilità maschile. I kit di Elucigene Male Factor Infertility sono disponibili nei formati elencati di
seguito. Per maggiori informazioni sui kit della gamma Male Factor Infertility, visitare il sito:
http://www.elucigene.com/product-category/reproductive-health/
Uso previsto
Male Factor Infertility
Per la diagnosi routinaria quantitativa in-vitro delle aneuploidie cromosomiche sessuali più comuni (ad
es. sindrome di Klinefelter) e le microdelezioni del cromosoma Y (AZFa, AZFb e AZFc) comunemente
associate al fattore maschile di infertilità. L'analisi comprende marker STR di cromosomi sessuali
XHPRT e DXYS218 e marker non STR AMEL, TAF9L e SRY per l'individuazione dello stato di
aneuploidia dei cromosomi sessuali. Il kit contiene anche i marker specifici del cromosoma Y sY84,
sY86, sY127, sY134, sY254 e sY255 per la determinazione dello stato delle microdelezioni del
cromosoma Y dei loci AZFa, AZFb e AZFc. La metodica impiegata dal kit Elucigene Male Factor
Infertility è la tecnica QF-PCR (reazione a catena della polimerasi quantitativa in fluorescenza). I
dispositivi sono destinati all'uso su DNA estratto da sangue intero (EDTA) e non sono previsti per
l'uso con altre matrici di test. La popolazione target di interesse è costituita da pazienti maschi con
sospetta infertilità che potrebbero presentare caratteristiche correlate, quali uno scarso numero di
spermatozoi. Il dispositivo è destinato all'uso congiuntamente ad altre procedure diagnostiche al fine
di supportare o scartare la diagnosi clinica proposta. Il dispositivo è destinato esclusivamente all’uso
professionale in ambiente di laboratorio citogenetico o molecolare.
Male Factor Infertility-Yplus (MFI-Yplus)
Kit supplementare contenente marker aggiuntivi di cromosomi Y, da utilizzare unitamente al Male
Factor Infertility per la diagnosi routinaria in vitro delle tre microdelezioni più comuni del cromosoma Y
associate all'infertilità maschile. Questo kit è disponibile per l'analisi estesa e la caratterizzazione
delle microdelezioni del cromosoma Y identificate con l'uso del kit Male Factor Infertility. La metodica
impiegata dal kit Elucigene MFI-Yplus è la tecnica QF-PCR (reazione a catena della polimerasi
quantitativa in fluorescenza). I dispositivi sono destinati all'uso su DNA estratto da sangue intero
(EDTA) e non sono previsti per l'uso con altre matrici di test. La popolazione target di interesse è
costituita da pazienti maschi con sospetta infertilità e che sono risultati positivi ad una microdelezione
del cromosoma Y. Il dispositivo è destinato all'uso congiuntamente ad altre procedure diagnostiche al
fine di supportare o scartare la diagnosi clinica proposta. Il dispositivo è destinato esclusivamente
all’uso professionale in ambiente di laboratorio citogenetico o molecolare.
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Riepilogo e spiegazione
Statisticamente, il 10-15% delle coppie sperimentano difficoltà di concepimento, con fattori correlati al
sesso maschile, ad es. scarso numero di spermatozoi, ritenuti essere alla base di quasi il 50% dei
casi. Bensì nella maggior parte le cause dell'infertilità maschile sono sconosciute, alcuni studi hanno
dimostrato che l'aneuploidia del cromosoma sessuale e le microdelezioni di specifiche regioni del
cromosoma Y possono essere i responsabili del problema (1).
La sindrome di Klinefelter è l'aneuploidia del cromosoma sessuale associata all'infertilità maschile più
comune. Questa sindrome ha un'incidenza di nati vivi tra 1:500 e 1:650 di maschi e la causa più
comune è una copia aggiuntiva del cromosoma X (47, XXY caritipo), questa alterazione è il difetto
genetico più frequente osservato nell'infertilità maschile. Le microdelezioni del cromosoma Y sono le
seconde cause genetiche più comuni dell'infertilità maschile (2), con microdelezioni che si verificano
in tre regioni (AZFa, AZFb, AZFc) identificate in fino al 7% dei casi di oligospermia (scarsa quantità di
spermatozoi) e il 13% di azoospermia non ostruttiva (assenza di spermatozoi) (1). Dette
microdelezioni si verificano a causa della ricombinazione omologa di sequenze ripetitive in tali regioni
e sono stati evidenziati i meccanismi molecolari esatti ed eventi di ricombinazione alla base di queste
alterazioni. Queste regioni sono ubicate sul cromosoma Yq11 e bensì la regione di microdelezione
AZFa sia differente, è presente un livello significativo di sovrapposizione tra le regioni interessate
dalla microdelezione della regione AZFb e AZFc (Figura 1).
Braccio lungo
AZFc
AZFb
Corto
AZFa
Figura. 1: Ubicazione dei cromosomi delle regioni di microdelezione AZFa, AZFb e AZFc sul
cromosoma Y (Poongothai et al., 2009).
L'identificazione delle cause genetiche dell'infertilità maschile può risultare in una gestione clinica più
efficace dei pazienti. Ad esempio, i pazienti con microdelezione che interessa la regione AZFc (la più
comune) presentano un fenotipo variabile (spesso dovuto al background genetico). Tuttavia, in
generale questi pazienti mostrano livelli residui di spermatogenesi e vi è un 50% di possibilità di
recuperare gli spermatozoi tramite TESE (estrazione testicolare di spermatozoi). Le coppie affette da
microdelezioni della regione AZFc potrebbero essere in grado di concepire con l'aiuto di tecniche di
fertilità assistita quali l'ICSI (iniezione intracitoplasmatica dello spermatozoo). Ciò contrasta con i
pazienti con microdelezioni totali nelle regioni AZFa, AZFb e AZFc da cui il recupero con successo di
spermatozoi funzionali è improbabile (2), anche se la probabilità aumenta se la delezione non è totale
(vedere Figura 2).
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Principi della procedura
La metodica impiegata dalla gamma di prodotti Elucigene Male Factor Infertility per produrre un test
multiplex che individua l'aneuploidia dei cromosomi X e Y (Male Factor Infertility) nonché le
microdelezioni del cromosoma Y (Male Factor Infertility e MFI-Yplus) è la tecnica QF-PCR (reazione a
catena della polimerasi quantitativa in fluorescenza)(3-7).
(i) Rilevazione dell'aneuploidia dei cromosomi sessuali
Utilizzando l’amplificazione mediante PCR, i primer marcati con un colorante fluorescente sono diretti
a individuare le regioni altamente polimorfiche delle sequenze di DNA denominate ripetizioni in
tandem brevi (short tandem repeat, STR) che sono localizzate sui cromosomi di interesse. Ogni
marker STR individuato è specifico per il cromosoma su cui si trova, pertanto il numero di copie del
marker STR può essere indicativo del numero di copie del cromosoma. Sono stati selezionati marker
STR informativi che mostrano un’elevata eterogeneità, in modo tale da determinare facilmente il
numero di copie, pertanto i due alleli diun STR specifico per un cromosoma vengono determinati dalla
tecnica QF-PCR come due picchi in rapporto 1:1. L’osservazione di un allele STR in più come profilo
a tre picchi in rapporto 1:1:1 o come profilo a due picchi in rapporto 2:1 o 1:2 è indicativo della
presenza di una sequenza aggiuntiva che a sua volta rappresenta un cromosoma aggiuntivo, come
nel caso di una trisomia.
(ii) Rilevamento della microdelezione del cromosoma Y
Nel 2004, la European Academy of Andrology (EAA) e l' European Molecular Genetics Quality
Network (EMQN) hanno suggerito una serie di migliori pratiche per testare la microdelezione del
cromosoma Y, valutando 2 marker mediante sito a sequenza etichettata (STS) tramite tecnica PCR
per ciascuna regione di delezione: AZFa- sY84 e sY86, AZFb- sY127 e sY134 e AZFc- sY254 e
sY255 (8). Nel 2014, queste linee guida sono state emendate al fine di includere l'analisi di
estensione che ha fornito ulteriore caratterizzazione e dimensionamento della microdelezione della
regione AZF rilevata, utilizzando un set separato di marker definiti: AZFa – sY82, sY1182, sY83 ed
sY88, AZFb – sY105, sY121, sY143 ed sY153, AZFc (gr/gr sottotipo) – sY1191 ed sY1291 (2).
Un'ulteriore caratterizzazione/dimensionamento delle microdelezioni della regione AZF è utile per la
maggiore probabilità di ottenere spermatozoi funzionali in pazienti con microdelezioni parziali che
presentano una delezione completa di una o più di queste regioni. Ad esempio, la microdelezione
gr/gr che costituisce una subdelezione della regione AZFc è tipicamente associata a un fenotipo più
blando rispetto alle delezioni complete. Infatti, la rilevanza clinica di questa subdelezione varia in base
al background genetico, essendo considerata la causa di un fenotipo di subfertilità in alcune
popolazioni ed è persino considerata "fissa" in alcuni aplotipi del cromosoma Y, comuni nella
popolazione giapponese senza alcun effetto sulla quantità di spermatozoi. I primer marcati con
colorante fluorescente specifici per la sequenza che affiancano tali marker amplificano la sequenza
wild-type mentre la perdita del picco diagnostico wild-type indica una microdelezione che copre
questo marker STS.
I prodotti amplificati ottenuti con la tecnica QF-PCR vengono analizzati in modo quantitativo con un
analizzatore genetico mediante elettroforesi capillare per determinare il numero di copie dei marker
STS analizzati.
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Delezione di
Delezione di
Delezione di
sY84, sY86
sY127, sY134
sY254, sY255
Ana lisi di est ens ione
Confine prossima le:
sY82 (+): sY83/sY106 4 (-)
Confine distal e:
sY106 5/sY118 (-):sY88 (+)
Ana lisi di est ens ione
Confine prossima le:
sY105 (+): sY121/sY122 4 (-)
Confine distal e:
sY143/sY119 2 (-):sY153(+)
Verific a del m arker di
eterocrom atina
sY160
Marker non compatibili con la
Delezione completa de lla
dele zione completa
regione AZFa di AZFb
Delezione completa de lla
regione AZFc
B2/b4 o te rmi nale [sY160 (-)]
Fenotipo test icolare se minale
Possibilità di TESE
variabile
virt ualmente zero
Rapporto contenente c onsigli
per consulenza genetica,
screening in parenti m aschi
Rapporto contenente c onsigli
per consulenza genetica
Possibilità di TESE all'incirca
50%
(dele zione b2/b4)
Rapporto contenente c onsigli
per consulenza genetica,
Cariotipo (possibilità 45,
mosaicismo X), screeninf in
parent i masc hi
Figura 2: Diagramma di flusso riportante le conseguenze cliniche della scoperta di ciascun tipo di
microdelezione del cromosoma Y comune (Krausz et al., 2014).
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Avvertenze e precauzioni
1. Il DNA di controllo fornito con il kit è stato testato indipendentemente ed è risultato negativo
per il virus dell'epatite B (HBV), dell'epatite C (HCV) e per il virus dell’immunodeficienza
umana 1 e 2 (HIV).
2. Si consiglia di maneggiare con cautela il materiale di origine umana. Tutti i campioni devono
essere considerati potenzialmente infettivi. Nessun metodo di analisi può offrire la certezza
assolutadell’assenza dei virus HBV, HCV e HIV o di altri agenti infettivi.
3. La manipolazione dei campioni e dei componenti del test, il loro utilizzo, la conservazione e lo
smaltimento devono avvenire in conformità con le procedure definite dalle rispettive linee
guida o regolamenti nazionali in materia di sicurezza in ambito biologico.
4.
In osservanza delle buone pratiche di laboratorio correnti, i laboratori devono analizzare i
propri campioni di controllo di qualità interni contenenti un genotipo noto in ciascuna analisi,
in modo da poter valutare la validità della procedura.
5. Se la scatola del kit è danneggiata, anche il contenuto potrebbe essere danneggiato; non
utilizzare il kit e contattare l’assistenza clienti.
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Simboli usati sulle etichette
I simboli utilizzati su tutte le etichette e confezioni sono conformi allo standard armonizzato
ISO 15223
Produttore
Quantità di test
Vedere le istruzioni per l'uso
X°C
Conservare al di sotto della temperatura indicata
Utilizzare prima della data indicata
Codice catalogo
Numero di lotto o partita
Dispositivo medico-diagnostico in vitro
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Materiali forniti
Kit Elucigene Male Factor Infertility
Ogni kit contiene:
Elucigene Male Factor Infertility (TA) (Cod. art. 450208): 1 x 250µl (25 test), miscela master
contenente primer per amplificare la STR (ripetizione in tandem breve) specifica di X e Y e marker
non-STR nonché marker della microdelezione del cromosoma Y. Per i dettagli dei marker in ogni kit,
vedere l'Appendice 2. La miscela Master contiene anche DNA polimerasi e trifosfati deossinucleotidi
trifosfati in soluzione tampone.
DNA Control (DC) (Cod. art. 404489): 1 x 50µl fiala di DNA Control, normale sia per i marker di
rilevamento dell'aneuploidia cromosomica sessuale sia per i marker di delezione del cromosoma Y
nel test Elucigene Male Factor Infertility.
Elucigene MFI-Yplus Kit
Ogni kit contiene:
Elucigene MFI-Yplus
(TA) (Cod. art. 450211) : 1 x 100 µl (10 test) di miscela master, contenente
primer per amplificare i marker del cromosoma Y. Per i dettagli dei marker in ogni kit, vedere
l'Appendice 2. La miscela master contiene anche DNA polimerasi e trifosfati deossinucleotidi trifosfati
in soluzione tampone.
DNA Control (DC) (Cod.art. 404489): 1 x 50µl fiala DNA Control, normale per i marker di delezione
del cromosoma Y nel test Elucigene MFI-Yplus.
Preparazione e conservazione del kit
All'apertura del kit si consiglia che la miscela master venga dispensata in fiale da 0.2ml PCR in volumi
da 10µle e congelata a -20°C. Accertarsi che il contenuto delle fiale sia accuratamente scongelato e
miscelato prima di essere dispensato.
Control DNA deve essere congelato a -20°C.
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Materiali necessari ma non forniti
In generale
Materiale di consumo di laboratorio: guanti, provette per microcentrifuga con tappo a vite, fiale per
PCR da 0.2ml PCR o piastre di microtitolazione consigliate dal produttore del termociclatore utilizzato,
puntali per pipette.
Apparecchiature di laboratorio: pipette di precisione (2 set: 1 per la pre-amplificazione e 1 per la
manipolazione post-amplificazione), indumenti di protezione, agitatore vortex, microcentrifuga,
centrifuga con piastra per microtitolazione a 96 pozzetti.
Amplificazione mediante PCR
Termociclatore adatto a contenere piastre per microtitolazione da 96 pozzetti o fiale da 0,2 ml, con
accuratezza di temperatura minima di +/-1 °C tra 33 °C e 100 °C e uniformità di temperatura statica di
+/-1 °C. Male Factor Infertility e MFI-Yplus sono stati convalidati e hanno mostrato di soddisfare le
specifiche sulle seguenti piatteforme termociclatore consigliate:





Life Technologies GeneAmp 9700
Life Technologies Veriti Dx (analisi in modalità standard)
Life Technologies Veriti Dx (analisi in modalità di simulazione 9700)
Life Technologies Proflex (analisi in modalità standard)
Life Technologies Proflex (analisi in modalità di simulazione 9700)
Elettroforesi capillare
Elettroforesi capillare –POP-7 Polimero (ABI Cat. N. 4352759), 10x analizzatore genetico in tampone
(ABI Cat. N. 402824) e formamide Hi-Di (ABI Cat N. 4311320), GeneScan 600v2 LIZ size standard
(ABI Cat. N. 4408399) e matrix standard DS-33 (set colori G5) (ABI Cat. N. 4345833).
Biosistemi applicati ABI 3130 e 3500 Analizzatori Genetici (con software GeneMapper), array di
capillari di 36cm (array di capillari di 50cm per 3500 Analizzatore genetico), piastre ottiche a 96
pozzetti, setti per 96 pozzetti, cassette per 96 pozzetti.
Dati delle analisi
È richiesto uno dei seguenti pacchetti software di analisi dati: GeneMapper 3.7 (Applied Biosystems
Inc.) o superiore o GeneMarker 1.65 (SoftGenetics LLC) o superiore.
Documentazione supplementare sul prodotto Elucigene Male Factor Infertility
Le presenti Istruzioni per l'uso comprendono una sezione base sull'interpretazione dei risultati
ottenuti. Una guida supplementare dei prodotti Elucigene Male Factor Infertility all'interpretazione con
esempi e glossario e una Guida al software di analisi sono disponibili sul sito Elucigene:
http://www.elucigene.com/product-category/reproductive-health/
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Prelievo e conservazione dei campioni
Campioni di sangue intero (in EDTA) sono stati giudicati compatibili con questo test.
È stato segnalato che talvolta i dispositivi di prelievo dei campioni hanno influito in modo negativo
sull’integrità di determinati analiti e che potrebbero interferire con alcune tecnologie metodologiche
(9). Si raccomanda a ciascun operatore di assicurarsi che il dispositivo selezionato sia usato
secondo le istruzioni della ditta produttrice e che i dispositivi di prelievo dei campioni siano compatibili
con questo test.
I campioni di sangue devono essere conservati a -20 °C prima della preparazione del DNA. Evitare di
congelare e scongelare ripetutamente il campione.
Preparazione di DNA da campioni di sangue intero (trattato con EDTA)
Si ottengono sempre risultati con DNA estratto con kit di sangue per DNA da 96 QIAamp (o il minikit
per DNA QIAamp con Proteinasi K) seguendo il protocollo descritto nel manuale QIAamp partendo
con 200l di sangue intero liquido e procedendo all’eluizione in 200l di acqua per biologia
molecolare.
Concentrazione del DNA
In condizioni ottimali e con l’utilizzo delle configurazioni raccomandate per l’iniezione dei campioni
impostate nei moduli di analisi per la colonna capillare (vedere la nota nella sezione Elettroforesi
capillare), si ottengono sistematicamente risultati accettabili con un quantitativo di DNA di input di 15
ng. Tuttavia, risultati interpretabili si ottengono con un range di DNA di input da 5ng a 30ng.
La quantificazione del DNA è molto importante: per garantire risultati ottimali, è necessario misurare
la concentrazione di ogni campione di DNA da analizzare. Sono accettabili tecniche quali la
fluorescenza PicoGreen o l’assorbenza UV. Data la varietà di tecniche per la quantificazione del
DNA, l’operatore dovrebbe adottare i seguenti accorgimenti:
Quantitativi molto elevati di DNA di input aumenteranno la probabilità che i picchi di fondo vengano
marcati dal software di analisi. Per ridurre la probabilità che i picchi di fondo vengano marcati, è
possibile seguire la procedura riportata di seguito.

Diluire il campione di DNA e ripetere l’amplificazione.

Ridurre il tempo di iniezione (vedere la sezione Elettroforesi capillare).

Aumentare la soglia di ampiezza minima dei picchi (vedere la Guida al software di analisi
Elucigene CF-EU2v1).
Bassi quantitativi di DNA di input aumenteranno la probabilità di ottenere picchi diagnostici deboli che
non vengono marcati dal software di analisi. Per aumentare il segnale, è possibile seguire la
procedura riportata di seguito.

Aumentare il tempo di iniezione (vedere la sezione Elettroforesi capillare).

Estrarre nuovamente il campione ed eluirlo in un volume di acqua ridotto (50l).
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Protocollo del test
Procedura di amplificazione
Nota: per ridurre al minimo il rischio di contaminazione, i passaggi 3 - 5 devono essere eseguiti in
un'area priva di DNA È inoltre necessario prendere provvedimenti per evitare la contaminazione
con il prodotto PCR
1. Programmare il termociclatore per un singolo passaggio per attivare la DNA polimerasi a
94°C per 20 minuti collegata ad un programma ciclico di amplificazione di 1 minuto a 94 °C
(denaturazione), 2 minuti a 58 °C (annealing) e 1 minuto a 72 °C (estensione) per 30 cicli.
Questo procedimento deve essere collegato ad un file di ritardo di 20 minuti a 72 °C
(estensione) sul ciclo finale.
2. Ciascun ciclo di PCR deve includere un controllo negativo (acqua). Potrebbe essere
opportuno includere anche altri controlli, ad es. il controllo maschile normale positivo (DNA
control fornito) e un controllo femminile normale (DNA non fornito).
3. Scongelare sufficienti fiale di miscela master pre-frazionata di prodotto Male Factor Infertility
(Male Factor Infertility o MFI-Yplus) per il numero di campioni e controlli da analizzare (vedere
nota in Materiali forniti) e centrifugare le fiale a 12,000g per 10 secondi.
4. Con punte di pipette separate, aggiungere 2.5µl di DNA di test a una fiala di campione
contenente 10µl di miscela master e miscelare pompando su e giù. Eseguire questa
procedura per tutti i campioni da testare.
5. Non aggiungere DNA alla fiala di PCR per il controllo negativo; sostituire con 2,5 μl di acqua
sterile deionizzata.
6. Centrifugare brevemente le fiale fino a quando tutto il liquido si trova in fondo ad ogni fiala.
7. Posizionare le fiale nel blocco del termociclatore in modo che siano stabili. Avviare il
programma di attivazione a 94 °C seguito dal programma di amplificazione (vedere
passaggio 1).
8. Al termine del programma ciclico di amplificazione, i campioni possono essere conservati a
temperatura ambiente per tutta la notte oppure a una temperatura compresa tra 2 °C e 8 °C
per un massimo di 7 giorni prima dell’analisi con elettroforesi capillare.
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Elettroforesi capillare
Si raccomanda a ciascun operatore di assicurarsi che l’apparecchiatura per elettroforesi capillare
selezionata venga usata secondo le istruzioni del produttore e che sia compatibile con questo test. In
questo contesto, i parametri chiave sono il polimero e l’array di capillari. È possibile ottenere risultati
ottimali utilizzando le seguenti condizioni di elettroforesi capillare su un Analizzatore genetico
ABI3130 o ABI3500.
1. Combinare 6,8 μl di GS600v2 LIZ size standard con 250 μl di formamide Hi-Di e miscelare
accuratamente (miscela sufficiente per 16 pozzetti). Dispensare 15 μl di miscela nel numero
richiesto di pozzetti di una piastra ottica da 96 pozzetti*.
2. Aggiungere 3 μl di prodotto di PCR del campione di test alla miscela size standard
(ottenuta con il passaggio 1) già dispensata nella piastra e miscelare con la pipetta.
Sigillare la piastra.
3. Denaturare il prodotto di PCR dispensato nella piastra ottica su un termociclatore
utilizzando i seguenti parametri: 94 °C per 3 minuti seguiti da 4 °C per 30 secondi.
4. Centrifugare la piastra a 1,000g per 10 secondi per eliminare eventuali bolle presenti
nei pozzetti, e caricare sull’analizzatore genetico.
*Nota: È fondamentale che i pozzetti inutilizzati (cioè i pozzetti in cui non è caricato alcun campione di
DNA) siano ancora caricati con formamide Hi-Di per garantire che i capillari non si secchino.
È possibile modificare le impostazioni di iniezione dei campioni in funzione della quantità di ampliconi
prodotti durante la PCR, che può variare a seconda della quantità di DNA di input genomico aggiunto.
Riducendo il tempo o la tensione di iniezione è possibile applicare una minore quantità di ampliconi
alla colonna di analisi. Aumentando invece il tempo o la tensione di iniezione èpossibile applicare
una maggiore quantità di ampliconi alla colonna di analisi. I campioni precedentemente amplificati
possono essere reiniettati più volte per ripetere le analisi.
Dati di analisi Post-PCR
ABI3130 ANALIZZATORE GENETICO
La gamma di prodotti Male Factor Infertility è stata concepita per essere compatibile con il prodotto
Elucigene CFEU2v1. Come tale, i prodotti Male Factor Infertility possono essere analizzati con i
Moduli e le impostazioni CFEU2v1 di analisi esistenti. In alternativa, l'operatore può creare un
modulo Male Factor Infertility (MFI) separato come segue.
Creare una scheda del campione utilizzando il software di acquisizione dati 3130 con le seguenti
impostazioni:
• Nome del campione: deve essere lo stesso nome o numero specifico del campione.
• Titolare dell'analisi: selezionare il titolare predefinito per lab.
• Protocollo dell'analisi: MFI (contiene il modulo di analisi MFI 3130)*.
*Nota: È necessario creare un modulo di analisi che specifichi le impostazioni dello strumento e
successivamente assegnarlo a un Protocollo di analisi in cui è stato selezionato set colori G5 . Per
maggiori informazioni sulla creazione di moduli dianalisi, consultare il Manuale dell'operatore dello
strumento.
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MODULO DI ANALISI 3130
PER POLIMERO POP7
Modulo per capillare da 36cm: MFI
Creare il modulo di analisi MFI nel Module Manager (Editor dei moduli) del software di acquisizione
dati 3130. Assicurarsi che siano selezionate le seguenti voci:
•
Type (tipo): Regolare
•
Template (Modello): FragmentAnalysis36_POP7
•
Immettere le impostazioni illustrate in dettaglio nella tabella seguente:
#
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
Nome del parametro
Valore
Temperatura forno
60
Volume riempimento poly
6500
Stabilità corrente
5,0
Tensione pre-analisi
15.0
Tempo pre-analisi
180
Tensione iniezione
3,0
Durata iniezione
12.0
Tensione numero di passaggi
20
Intervallo passaggio tensione
15
Tempo di ritardo dati
60
Tensione analisi
15.0
Tempo di analisi
1200
Intervallo
int 18…65 °C
6500…38000 passaggi
int 0…2000 uAmp
0…15 kvolt
1…1000 sec.
1…15 kvolt
1…600 sec.
1…100 nk
1…60 sec.
1…3600 sec.
0…15 kvolt
300…14000 sec.
*Nota: Il "tempo di analisi" necessario varia a seconda della temperatura ambiente del luogo in cui è
stato installato l’analizzatore genetico. Per maggiori informazioni sulla creazione di moduli dianalisi,
consultare il Manuale d'uso dell'Analizzatore genetico Applied Biosystems 3130.
Creare il protocollo MFI nel Protocol Manager (Editor dei protocolli) e assicurarsi che siano
selezionate le seguenti voci:
•
Type (Tipo): Regolare
•
Run Module (Modulo di analisi): MFI (vedere modulo di analisi sopra)
•
Dye Set (Set colori): G5
Per analizzare i campioni, creare una scheda campioni utilizzando il Plate Manager (editor della
piastra);assicurarsi che sia stato selezionato il protocollo adatto al protocollo dello strumento (vedere
sopra).
Nota: Per maggiori informazioni sulla configurazione, sul funzionamento e sulla risoluzione dei
problemidello strumento, consultare il Manuale dell’operatore dell’analizzatore genetico Applied
Biosystems3130.
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Giugno 2015
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Prodotti Elucigene® Male Factor Infertility Istruzioni per l'uso
ABI3500 GENETIC ANALYZER (ANALIZZATORE GENETICO)
È necessario creare un Instrument Protocol (Protocollo dello strumento) MFI che può essere utilizzato
successivamente per ciascuna analisi di prodotto Male Factor Infertility.
Creare l'Instrument Protocol (protocollo dello strumento) mediante la libreria dei protocolli dello
strumento 3500.
Assicurarsi che siano selezionate le seguenti voci:
•
Run Module (Modulo di analisi): FragmentAnalysis50_POP7
• Immettere le impostazioni illustrate in dettaglio nella figura seguente:
Per analizzare i campioni, creare una piastra campione facendo click su ‘Create Plate from
Template’(crea piastra da modello) nel ‘Dashboard’; assicurarsi che sia stato assegnato il protocollo
dello strumento corretto per MFI (vedere sopra).
ANXYAZFIT 001
Giugno 2015
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Prodotti Elucigene® Male Factor Infertility Istruzioni per l'uso
Scheda campione impostata per GeneMarker:
Il software GeneMarker consente il confronto diretto tra i dati A e B dello stesso individuo. Per
facilitare questo confronto è importante che la denominazione del file di output dei dati non elaborati
(FSA) sia coerente per tutti i campioni e le miscele. La scheda campione deve contenere il nome del
campioneunivoco per ogni campione analizzato seguito dal suffisso _A o _B a seconda delle miscela
che sarà analizzata. Se nel nome FSA si deve includere l’ID piastra occorre usare ogni volta un
formato fisso, ad esempio MFI GGMMAAAA.
Sullo strumento 3130 occorre configurare i parametri per "Results Destination" (destinazione risultati)
in modo che il nome del file FSA includa il nome del campione, ad esempio MFI
GGMMAAAA_1234,5_A_A01.
Sullo strumento 3500 occorre impostare la convenzione del nome file in modo che il nome del file
FSAcomprenda il nome del campione, ad esempio MFI GGMMAAAA_1234,5_A_A01.
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Prodotti Elucigene® Male Factor Infertility Istruzioni per l'uso
Analisi e interpretazione dei risultati
Interpretazione generale dei risultati
I prodotti di PCR vengono osservati in un sistema marcato con 5 coloranti utilizzando il set di filtri G5.
Il set di filtri G5 permette di rilevare i frammenti marcati con 6-FAM (blu), VIC (verde), NED (giallo) e
PET (rosso) più il marker size standard marcato con LIZ (arancione) su un elettroferogramma con il
programma GeneMapper o GeneMarker.
http://www.elucigene.com/product-category/reproductive-healt/
Nota importante: Le diverse combinazioni di strumenti, polimeri e size standard possono causare
lievi variazioni nell’assegnazione delle dimensioni. Durante la convalida del kit, gli operatori devono
controllare che le impostazioni del bin di default siano etichettature di picco precise e qualora
necessario, regolarle. In caso di difficoltà, contattare l'assistenza tecnica
([email protected]).
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Giugno 2015
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Prodotti Elucigene® Male Factor Infertility Istruzioni per l'uso
Linee guida generali di analisi per tutti i prodotti Male Factor Infertility
1. Il controllo negativo non deve mostrare picchi alti e stretti nell’intervallo di valori compreso tra
100 bp e 550 bp.
2. Il controllo positivo deve mostrare i risultati attesi e tutti i picchi devono soddisfare i criteri
riportati di seguito.
3. Per l’analisi di aneuploidia dei campioni di DNA si deve osservare almeno 1 picco per ogni
marker analizzato. L’intervallo accettabile per i picchi dei marker analizzati con l’analizzatore
genetico 3130 è compreso tra 50 e 6000 unità di fluorescenza relativa (rfu) sia per l'analisi di
aneuploidia sia di microdelezione, mentre per i marker analizzati con gli analizzatori genetici
3500 è compreso tra 175 e 32000 rfu. Le altezze dei picchi che cadono al di fuori di questo
intervallo non devono essere analizzate.
4. Gli elettroferogrammi di scarsa qualità dovuta ad eccessivo spargimento (bleedthrough) tra i
coloranti (fenomeno noto anche col termine di "pull-up") o "spikes elettroforetici" (picchi alti e
stretti presenti in più di un colorante) non devono essere interpretati. I prodotti di PCR
devono essere reiniettati e rianalizzati.
5. L’analisi di aneuploidia viene eseguita valutando il rapporto tra i picchi (A1/A2), dove A1 è
l’area del picco del frammento più corto e A2 è l’area del picco del frammento più lungo Il
rapporto che ne deriva è indicativo del numero di copie dei loci. Per le disomie
cromosomiche, i marker eterozigoti devono mostrare due picchi con altezze simili. Un’analisi
completa dello stato del numero di copie dei cromosomi viene effettuata tramite confronto dei
rapportidelle aree di picchi.
6. I marker eterozigoti diallelici (cioè due alleli) devono cadere in un intervallo di rapporti
compreso tra 0,8 e 1,4. Tuttavia, per due alleli le cui dimensioni si discostano di più di 24 bp,
è accettabile un rapporto non superiore a 1,5. Qualunque valore che cade all’interno di
questo intervallo viene considerato rientrante nel rapporto 1:1. Se il bilanciamento dei
rapporti cade al di fuori di questo intervallo, la causa potrebbe essere attribuita a vari fattori,
tra cui:

Trisomia cromosomica completa (cromosoma sessuale)

Trisomia cromosomica parziale (incluse le duplicazioni submicroscopiche)

Mosaicismo

Contaminazione secondo genotipo

"Stutter" (artefatti costituiti da picchi più piccoli rispetto al picco principale) che causano
"skewing" (deviazioni significative del rapporto 1:1);

Amplificazione preferenziale di un allele che causa "skewing";

Polimorfismo in corrispondenza dei siti di legame dei primer

Mutazioni somatiche nelle regioni microsatelliti
La Guida all'interpretazione dei prodotti Elucigene Male Factor Infertility disponibile sul sito web
di Elucigene contiene degli esempi di profilitipici per molti di questi casi. I marker omozigoti non
forniscono informazioni utili in quanto non è possibile determinare un rapporto.
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Prodotti Elucigene® Male Factor Infertility Istruzioni per l'uso
Analisi di marcatori del cromosoma sessuale AMEL, TAF9, XHPRT, DXYS218 e SRY (Test di
Male Factor Infertility):
Per interpretare un risultato come anomalo è necessario individuare almeno due marker informativi
coerenti con il genotipo a tre alleli mentre tutti gli altri marker possono risultare non informativi. Non è
consigliabile interpretare un risultato come anomalo basandosi sulle informazioni ottenute da un unico
marker.
1. Il marker AMEL amplifica le sequenze non polimorfiche sui cromosomi X (104 bp) e Y (110
bp), può essere utilizzato per determinare la presenza o l’assenza di un cromosomaY e
rappresenta la quantità di sequenze X rispetto alle sequenze Y. In rare occasioni è stato
segnalato che l’amplificazione non avviene a causa di una mutazione nella sequenza AMELY.
2. TAF9L è un marker paralogo invariabile con sequenze sui cromosomi 3 e X. Il picco specifico
per il cromosoma 3 (116 bp, che rappresenta 2 copie del cromosoma 3) puòessere quindi
usato come picco di riferimento per determinare il numero di cromosomi X presenti (picco da
121 bp). Analizzato in combinazione con l’amelogenina e con gli altrimarker dei cromosomi
sessuali, è particolarmente utile nella diagnosi dell’aneuploidia dei cromosomi sessuali. In un
individuo normale di sesso femminile i marker devono cadere nell’intervallo di rapporti
compreso tra 0,8 e 1,4. In un individuo normale di sesso maschile i marker devono fornire un
rapporto maggiore o uguale a 1,8. Maggiori dettagli sull'interpretazione del marker TAF9L
sono disponibili nella Guida all'interpretazione dei prodotti Elucigene Male Factor
Infertility.
3. I marker STR polimorfici DXYS267 e DXYS218 sono presenti su entrambi i cromosomi X e Y
e rappresentano il numero totale di cromosomi sessuali Per i risultati informativi riferiti a
individui maschi non è possibile stabilire quale allele rappresenti il cromosoma Xo il
cromosoma Y.
4. Il marker informativo XHPRT specifico dell'X rappresenta il numero di cromosomi X.
5. Il marker specifico per il cromosoma Y, SRY, fornirà un singolo picco negli individui normali di
sesso maschile e non verrà amplificato negli individui normali di sessofemminile.
Analisi di marker di microdelezione del cromosoma Y (Male Factor Infertility e MFI-Yplus):
1. Tutti i marker di microdelezione del cromosoma Y sono rappresentati da un picco singolo. La
perdita di un picco corrisponde a una microdelezione di quella regione.
2. Il marker ZFX/ZFY rappresenta sequenze sia sul cromosoma X che su quello Y. Dato che
l'amplicone generato da entrambe le sequenze non può essere distinto per dimensione,
questo marker fornirà un picco singolo indipendentemente dal sesso del campione. Questo
marker non è previsto per l'uso diagnostico, ma serve come controllo dell'amplificazione.
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Prodotti Elucigene® Male Factor Infertility Istruzioni per l'uso
GeneMapper Guida all'analisi
Importazione e analisi dei file del prodotto Male Factor Infertility
1. Aprire il file del programma GeneMapper
2. Fare clic sul pulsante
per aggiungere file di dati a un nuovo progetto. Cercare il
luogo in cui sono salvati i file di dati grezzi .fsa, evidenziare i file di dati appropriati e
fare clic sul pulsante "Add to List>>" (Aggiungi alla lista) .
3. Apparirà la cartella di analisi nella finestra "Samples to Add" (Campioni da
aggiungere). Facendo due volte clic sull'icona della cartella di analisi, in questa
finestra sarà visualizzato ogni file .fsa da importare. Si aggiungono poi i campioni
facendo clic su
in fondo allo schermo. I file di dati appariranno ora all'interno
dello schermo principale di GeneMapper (figura 2)
Figura 2: Campioni pronti per essere aggiunti al progetto
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Importazione delle impostazioni di analisi del prodotto Male Factor Infertility nel
GeneMapper Manager
È necessario importare le impostazioni di Male Factor Infertility per GeneMapper. Questo processo
viene controllato tramite l'interfaccia "GeneMapper Manager". Le impostazioni del prodotto Male
Factor Infertility GeneMapper sono disponibili sul sito web di Elucigene:
http://www.elucigene.com/product-category/reproductive-health/
1. Avviare il programma "GeneMapper Manager", facendo clic sull'icona
.
2. Selezionare la scheda "Analysis Methods" (Metodiche di analisi) e fare clic sul pulsante di
importazione
3. Cercare i file delle impostazioni dell'analisi del prodotto Male Factor Infertility necessari (Male
Factor Infertility o MFI-Yplus (3130 o 3500)) e importarli.
4. Ripetere il processo selezionando la scheda corretta e importando i rispettivi file per:

Table Settings (Impostazioni tabelle)

Plot Settings (Impostazioni grafico)

Size standards (Size standard)
Nota: Cluster Plot Settings (Impostazioni grafico cluster), Matrices (Matrici), SNP Sets (Set
SNP) e Report Settings (Impostazioni rapporti) non richiedono l’importazione di file.
Nota*: Se i test Male Factor Infertility o MFI-Yplus vengono effettuati insieme al test
Elucigene CFEU2 (fibrosi cistica), può essere utilizzata l'impostazione size standard CFEU2.
Importazione delle impostazioni Male Factor Infertility Product in Panel Manager
(Gestione pannelli)
È necessario importare le impostazioni del file bin e dei pannelli Male Factor Infertility e MFI Y-plus
per GeneMapper. Questo processo viene controllato tramite l'interfaccia "Panel Manager".
Le impostazioni dei file bin e dei pannelli del prodotto Male Factor Infertility GeneMapper sono
disponibili sul sito web di Elucigene:
http://www.elucigene.com/product-category/reproductive-health/
1. Aprire il programma Panel Manager facendo clic sull'icona
.
2. Fare clic su "Panel Manager" (Gestione pannelli) nella finestra di navigazione sinistra. Panel
Manager appare ora evidenziato in celeste.
3. Selezionare "File/Import Panels" (File/importa pannelli). Cercare il file dei pannelli
GeneMapper Male Factor Infertility_Panels.txt’ e importarlo (Figura 4). In alternativa, per
MFI-Yplus selezionare MFI Y-plus_Panels.txt.
4. Il file dei pannelli verrà ora visualizzato nella finestra di navigazione sinistra. Fare clic sul file
dei pannelli per accertarsi che sia evidenziato in celeste.
5. Selezionare "File/Import Bin Set" (File/Importa set bin). Cercare il file bin GeneMapper "Male
Factor Infertility_Male Factor Infertility_ bins.txt" e importarlo (Figura 5). In alternativa,
per MFI-Yplus selezionare MFI Y-plus_ MFI Y-plus_bins.txt.
6. Fare clic su "Apply" (Applica) e poi su "OK".
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Prodotti Elucigene® Male Factor Infertility Istruzioni per l'uso
Figura 4: Importazione del File dei pannelliTest di Male Factor Infertility
Figura 5: Importazione del File bin Test Male Factor Infertility
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Prodotti Elucigene® Male Factor Infertility Istruzioni per l'uso
Modifica del file dei parametri di analisi
Potrebbe essere necessario modificare la voce predefinita "Analysis Ranges" (Intervalli di analisi)
nelle impostazioni di analisi QST*R in previsione delle variazioni a livello locale delle condizioni di
analisi. L’intervallo minimo di analisi dipenderà dal capillare e dal polimero utilizzati durante
l’acquisizione dei dati.
Per visualizzare le attuali impostazioni di analisi:
1. Aprire "GeneMapper Manager" facendo clic sull'icona
.
2. Selezionare la scheda "Analysis Methods" (Metodiche di analisi). Il file importato del
prodotto Male Factor Infertility sarà elencato come "Male Factor Infertility Analysis
Settings" (Impostazioni analisi Male Factor Infertility) per Male Factor Infertility o "Male
Factor Infertility Y-plus" per MFI-Yplus.
3. Fare clic su "Male Infertility Panel" (Panello Male Fertility) per Male Factor Infertility o ‘Male
Factor Infertility Y-plus’ per MFI-Yplus. La riga appare ora evidenziata.
4. Fare click sul pulsante "Open" (Apri) e selezionare la scheda "Peak Detector" (Rivelatore
picco) (Figura 6)
Figura 6: Intervalli di analisi.
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Prodotti Elucigene® Male Factor Infertility Istruzioni per l'uso
Per individuare il corretto intervallo di analisi per il proprio laboratorio:
1. Nella finestra principale di GeneMapper, fare doppio clic sulla cartella di analisi importata per
visualizzare un elenco dei file .fsa in essa contenuti.
2. Selezionare un file .fsa.
3. Facendo click sulla scheda "Raw data" (Dati grezzi) viene visualizzato un elettroferogramma
dei dati grezzi.
4. Utilizzando come guida il primo picco del size standard (ad es., 60 bp di GS600LIZv2),
selezionare un punto di dati di circa 100 punti più largo (Figura 7). In questo modo si
determina il punto più basso nell’intervallo analizzabile.
5. Assicurarsi che l’intervallo massimo di analisi comprenda il picco più largo del size standard
(600bp per GS600LIZv2).
6. Inserire i nuovi valori nel file di analisi QST*R (per accedervi procedere come indicato sopra).
Figura 7: Individuazione dell’intervallo minimo utilizzando i dati grezzi dei campioni
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Prodotti Elucigene® Male Factor Infertility Istruzioni per l'uso
Analisi dei file di pannello del prodotto Male Factor Infertility importati
1. Nella finestra principale di GeneMapper selezionare GeneMapper, selezionare "Male Factor
Infertility Table Settings" (Impostazioni tabella Male Factor Infertility) (Figura 8)
Figura 8 Impostazione impostazioni tabella
2. In "Analysis Method" (Metodiche di analisi) selezionare "Male Factor Infertility Analysis
Settings" Impostazioni Male Factor Analysis) o "Male Factor Infertility Y-plus" per Male
Factor Infertiity o MFI-Yplus rispettivamente. Riempire ciascuna colonna premendo i tasti
"Ctrl+D". Ripetere questo processo selezionando "Male Factor Infertility" o "MFI Y-plus"
sotto l'intestazione del "Panel" (Pannello) e "Male Factor Infertility Size Standard" sotto
l'intestazione "Size Standard". Ogni volta ricordarsi di riempire premendo "Ctrl+D" per
accertarsi che ogni impostazione sia applicata alla lista intera di campioni.
3. Fare clic su
per avviare l'analisi dei campioni. Assegnare un nome al progetto quando
viene richiesto.
Esame dei dati del prodotto Male Factor Infertility
1. Selezionare il campione da analizzare (evidenziare la riga del campione).
2. Fare clic su
per "Display Plots" (Visualizzare i grafici).
3. Selezionare "Male Factor Infertility Plot Settings" (Impostazioni del grafico MaleFactor
Infertility) (Figura 9) o "MFI Y-plus" secondo il quale il test viene analizzato.
Figura 9: Impostazioni del grafico Male Factor Infertility, menu a discesa.
4. Nella finestra del grafico viene visualizzato il profilo del campione con i dati tabellari (Figura
10).
GeneMarker assegna automaticamente le etichette a non più di due picchi per ciascun
marker. Se per un marker sono presenti tre alleli, il terzo picco non etichettato dovrà essere
etichettato manualmente (vedere: Manual Editing of Profiles (Modifica manuale dei profili,
sotto).
Note: Gli intervalli dell’entità di ciascun marker si basano sui dati precedentemente osservati. Gli alleli
rari
potrebbero cadere al di fuori di un dato intervallo dell’entità del marker e potrebbe essere necessario
regolare
il set bin di conseguenza.
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5. Si consiglia di attivare l’opzione "Single click editing" (Modifica con singolo clic). A tal fine
selezionare "Alleles/set click editing" (Alleli/imposta modifica con clic) assicurarsi che
questa opzione sia selezionata.
Figura 10: Finestra dei grafici dei campioni in cui sono visualizzati i dati dei tracciati etichettati e la
relativa tabella dei genotip
Modifica manuale dei profili
AVVERTENZA!
GeneMapper assegnerà le etichette solo a non più di 2 picchi per marker. Pertanto, potrebbe essere
necessario modificare i profili manualmente, ossia quando occorre assegnare le etichette ai terzi
picchi (se presenti) o quando occorre rimuovere le etichette dai picchi "stutter".
Per aggiungere l’etichetta a un picco, fare clic con il pulsante sinistro del mouse sul picco non
etichettato. Viene visualizzata l’opzione che consente di aggiungere un commento ad un allele. Fare
click su "OK". Il picco viene ora etichettato con le informazioni relative alle dimensioni, espresse in
paia di basi, e all’area del picco. Il picco appena etichettato verrà incorporato automaticamente nella
tabella.
Per rimuovere l’etichetta da un picco, fare clic con il pulsante sinistro del mouse sull’etichetta del
picco. Viene visualizzata l’opzione che consente di eliminare il commento relativo ad un allele. Fare
click su "OK". L'etichetta del picco viene ora rimossa. I dati eliminati relativi al picco verranno
automaticamente rimossi dalla tabella.
Copia dei dati tabellari
1. Evidenziare tutte le righe della tabella in basso nella finestra dei grafici.
2. Copiare le righe selezionate premendo i tasti "Ctrl+C".
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Guida all'analisi GeneMarker
Aggiunta di file dei campioni a GeneMarker
Aprire il file del programma GeneMarker e selezionare "Open Data" (Apri dati) quando richiesto.
Viene visualizzata la finestra Open Data Files (Apri file di dati).
Fare click sul pulsante "Add"(Aggiungi). Viene visualizzata la finestra di dialogo Open (Apri). Cercare
la directory contenente i file di dati grezzi;
1. Selezionare tutti i file premendo i tasti CTRL+A o utilizzare i tasti CTRL e/o MAIUSC per
selezionare singoli campioni.
2. Fare clic sul pulsante "Open" (Apri) nella finestra di dialogo Open (Apri). I file selezionati
verranno visualizzati nel campo Data File List (Elenco file di dati) (Figura 11).
Figura 11: Campioni aggiunti all’elenco dei file di dati.
3. Fare click sul pulsante "OK" nella finestra Open Data Files (Apri file di dati) e i campioni
saranno caricati in GeneMarker. Il software apre quindi automaticamente la finestra Raw Data
Analysis (Analisi dati grezzi) (Figura 12).
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Figura 12: Finestra Raw Data Analysis (Analisi dati grezzi)
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Importazione delle impostazioni dei pannelli del prodotto Male Factor Infertility
È necessario importare le impostazioni dei pannelli per il prodotto Male Factor Infertility per
GeneMarker. Questo processo viene controllato tramite l’interfaccia "Panel Editor" (Editor Pannelli).
Le impostazioni dei pannelli del prodotto Male Factor Infertility GeneMarker sono disponibili sul sito
web di Elucigene:
www.elucigene.com/product-category/reproductive-health/
1. Aprire "Panel Editor" (Editor pannelli) dal menu a discesa "Tools" (Strumenti) (Figura 13).
Figura 13: Selezione di Panel Editor
2. Selezionare "Import Panels" (Importa pannelli) dal menu a discesa "File" (figura 14)
Figura 14: Importazione dei pannelli
3. Cercare, ad esempio, il pannello GeneMarker MFI.xml o GeneMarker Y-plus e importarlo.
4. Ripetere il processo come indicato per gli altri rispettivi file dei pannelli.
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Elaborazione dei dati
Dopo il caricamento in GeneMarker, i file di dati grezzi sono pronti per essere elaborati. La fase di
elaborazione include l’applicazione di un size standard, l’applicazione di filtri ai picchi che generano
interferenze e, volendo, il confronto con un pannello di alleli noto.
GeneMarker combina tutte queste fasi in un unico, semplice strumento denominato "Run Wizard"
(Procedura guidata di analisi) (Figura 15). Per accedere alla procedura guidata di analisi basta fare
clic sull’icona "Run Project" (Progetto di analisi) nella barra degli strumenti principale.
Run Wizard (procedura guidata di analisi) - Creazione di un modello di analisi
necessario creare un modello di analisi al primo utilizzo del software per analizzare il prodotto Male
Factor Infertility. Tale operazione viene eseguita tramite la Run Wizard (procedura guidata di analisi).
1. Per accedere alla Run Wizard, basta fare clic sull'icona "Run Project" (Progetto di analisi)
nella barra degli strumenti principale.
2. Assegnare un nome al modello, ad es. QSTR.
3. Selezionare il Panel (pannello), il Size Standard, il Standard Colour (colore dello standard) e il
Analysis Type (tipo di analisi) come illustrato sotto nella figura 15.
4. Fare click su "Save" (Salva) per memorizzare il modello da utilizzare nelle analisi future.
5. Fare click su "Next" (Avanti) per continuare.
Figura 15: Run Wizard – Finestra Template Selection (selezione del modello)
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Run Wizard (procedura guidata di analisi) - Data Process (Elaborazione dati)
La finestra Data Process (Elaborazione dati) della Run Wizard (procedura guidata di analisi) consente
all'operatore di selezionare i parametri dei filtri da applicare ai picchi.
1. Selezionare le impostazioni di analisi appropriate nella finestra Data Process (Elaborazione
dati) come illustrato nella figura sotto (Figura 16).
2. Fare click su "Next" (Avanti) per continuare.
Nota: L’impostazione dell’intervallo di analisi nella finestra di analisi dei dati grezzi varia in base al
polimero utilizzato durante la raccolta dei dati. L’operatore deve selezionare un valore di partenza del
punto di dati che includa il picco del size standard di 60bp.
Figura 16: Run Wizard (procedura guidata di analisi) - Finestra Data Process (Elaborazione dati)
Nota: Per 3500 dati, aumentare l'Intensità minima a 150
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Run Wizard (procedura guidata di analisi) – Additional Settings (Altre impostazioni)
Non sono necessarie altre impostazioni (Figura 17).
1. Fare clic su "OK" per continuare.
Figura 17: Run Wizard (procedura guidata di analisi) – Additional Settings (Altre impostazioni)
Finestra Data Processing (Elaborazione dei dati)
Dopo aver fatto clic su "OK" nella finestra Run Wizard Additional Settings (Procedura guidata di
analisi - Altre impostazioni), viene visualizzata la finestra Data Processing (Elaborazione dei dati)
(Figura 18). I dati grezzi vengono elaborati e calibrati, quindi vengono applicati i parametri dei filtri e il
pannello selezionato.
1. Fare click su "OK" nella finestra Data Processing (Elaborazione dei dati) quando l'analisi è
completata.
Figura 18: Finestra Data Processing (Elaborazione dei dati)
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Finestra di analisi principale
La finestra di analisi principale (Figura 19) di GeneMarker presenta un formato facile da usare.
Questo formato include:
 elenco dei file dei campioni - visualizzato a sinistra nella finestra;
 immagine gel sintetica - visualizzata nella parte superiore della finestra;
 elettroferogrammi dei dati - sotto l’immagine gel;
 tabella dei rapporti - visualizzata sul lato destro della finestra.
In questa finestra è importante verificare che tutti i picchi appropriati in ciascun profilo siano stati
assegnati correttamente.
1. Fare doppio clic su ciascun campione in sequenza nell’elenco dei file dei campioni sul lato
sinistro della schermata. Fare clic con il pulsante destro del mouse su qualsiasi picco in
questione e scegliere tra le opzioni nella finestra di dialogo, ad esempio modificare o
eliminare alleli, confermare o meno come pertinente.
2. Nella finestra di analisi principale selezionare l’opzione del menu a discesa "Applications"
(Applicazioni) nella parte superiore della schermata. Selezionare "Trisomy Analysis" (Analisi
trisomia). Verrà visualizzata la finestra Trisomy Analysis Settings (Impostazioni analisi
trisomia) (Figura 20).
Figura 19: Finestra Main Analysis (Analisi principale)
Figura 20: Finestra Trisomy Analysis Settings (Impostazioni analisi trisomia)
Nota: Per 3500 dati, aumentare l’intensità minima a 150
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Trisomy Analysis Settings (impostazioni per l’analisi della trisomia)
Nella finestra Trisomy Analysis Settings (Impostazioni analisi trisomia) sono disponibili due schede:
1. Scheda Analysis (Analisi).
2. Scheda Statistics Plot (Grafico statistico)
Scheda Analysis (Analisi)
La scheda Analysis (Analisi) fornisce le opzioni di impostazione soglia per l’analisi della trisomia.
Assicurarsi che nella finestra di analisi sia selezionato "BPG" e che siano visualizzate le seguenti
impostazioni:
 Peak Height (Altezza picco) 50: altezza minima di 50 per l'assegnazione dei picchi (150 se si
utilizzano 3500 dati)
 Height Ratio (Rapporto altezze) 30%: massima percentuale del picco principale che il
secondo picco deve raggiungere affinché possano essere identificati due alleli.
 Quantification by Peak Area (Quantificazione per Area picco).
 Casella di controllo Lunghezza minore/maggiore selezionata.
 Valori soglia del Trisomy Ratio (rapporto della trisomia) compresi tra 0,80 e 1,40.
 Casella di controllo Apply Linear Correction (Applica correzione lineare) deselezionata.
 Fare clic su "OK"
Finestra Trisomy Analysis (Analisi trisomia)
La finestra Trisomy Analysis (Analisi trisomia) (Figura 21) permette all’operatore di esaminare i dati
dei campioni di aneuploidia
e di visualizzare il rapporto dei picchi per ciascun marker, nonché di accedere al rapporto di
GeneMarker.
Nella finestra vengono visualizzate numerose funzioni che assistono l’operatore nell’analisi dei dati:
Esse sono:
 Sample List (Elenco dei campioni)
 Electropherogram (Elettroferogramma)
 Ratio Plot (Grafico intervalli)
 Report Table (Tabella rapporti)
Si fa notare che l'analisi di Trisomia non è necessaria per i dati di microdelezione del cromosoma Y.
Figura 21: Finestra Trisomy Analysis (Analisi trisomia)
Per informazioni più dettagliate sulle funzioni di analisi della trisomia e sul loro utilizzo, consultare il
GeneMarker Manual (Manuale GeneMarker).
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Rapporto GeneMarker
GeneMarker include un modello di rapporto compatibile con i kit Elucigene Male Factor Infertility
(questa funzione non è necessaria per l'analisi dei dati dal test MFI-Yplus). Per accedere al rapporto
fare clic sull’icona "Print" che si trova in alto a sinistra nella barra degli strumenti della finestra Trisomy
Analysis (Analisi trisomia).
Verrà visualizzata la finestra delle Trisomy Print Settings (impostazioni di stampa della trisomia
(Figura 22).
Finestra delle Trisomy Print Settings (impostazioni di stampa della trisomia)
Nella finestra delle impostazioni di stampa della trisomia sono elencate le opzioni per l’inclusione e la
visualizzazione dei dati dei campioni nel rapporto GeneMarker.
Selezionare le opzioni come illustrato nella figura 22. Assicurarsi che le impostazioni relative alla
casella "Custom Size Range" (Mostra intervallo dimensioni personalizzate) siano comprese tra 98bp
(Inizio) e 600bp (Fine).
Figura 22: Finestra delle Trisomy Print Settings (impostazioni di stampa della trisomia)
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Anteprima del rapporto GeneMarker
Fare clic su "Preview" (Anteprima) per visualizzare il rapporto GeneMarker (Figura 23). Da questa
finestra l’operatore può esaminare e stampare tutti i dati relativi al picco del campione attraverso tutti i
marker, ottenendo un semplice rapporto del campione di una o due pagine.
Figura 23: Rapporto GeneMarker
Il rapporto GeneMarker include le seguenti funzioni:

Report Header (Titolo del rapporto): contiene informazioni sull’analisi, sul progetto, sul
campione e sui parametri.

Signature Box (Casella delle firme): data e spazio per le iniziali dei revisori del rapporto.

Electropherogram (Elettroferogramma): simile a quello della finestra Trisomy Analysis
(Analisi trisomia); in esso vengono visualizzati tutti i coloranti del tracciato del campione.

Report Table (Tabella dei rapporti): vengono visualizzati i valori relativi ai picchi e ai marker
selezionati per il campione corrente. I riferimenti alla trisomia sono evidenziati in grigio. La
tabella contiene anche una colonna di controllo per le iniziali dei revisori.

Corrected Ratio Plot (Grafico degli intervalli corretto): contiene i punti del grafico dell’intero set
di dati per tutti i marker presenti nel colorante. Le forme dei simboli rappresentano i diversi
marker e possono essere decifrate dalla riga “Symbol” (Simbolo) nella "Report Table"
(Tabella dei rapporti). I simboli con sfondo giallo rappresentano i punti di dati relativi al
campione corrente. I simboli con contorno rosso rappresentano i riferimenti alla trisomia.
Nota: Il grafico dei rapporti corretto è riportato nella seconda pagina per ogni campione solo quando
nella finestra delle impostazioni di Trisomy Print Report Settings (stampa del rapporto della trisomia)
è selezionata la casella Ratio Plot (Grafico dei rapporti)
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APPENDICE 1: Etichette di colore
I marcatori sono marcati:
Male Factor Infertility
NED
VIC
sY84
AMEL
sY86
TAF9L
sY127
SRY
sY134
XHPRT
sY254
DXYS218
sY255
ZFX/ZFY
MFI-Yplus
6-FAM
SY82
SY83
SY88
SY105
SY121
SY143
SY153
SY160
SY1182
SY1191
SY1291
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APPENDICE 2: - Tabella di posizione marker, eterozigosità osservata, intervallo
dimensioni alleli
Male Factor Infertility
Marker
Posizione
Eterozigosità
osservata*
Intervallo bin (bp)
Colorante marker
AMEL
Xp22.22/Yp11.2
n/a
102,5112.5
verde
TAF9
3p24.2/Xq21.1
n/a
113/122.5
verde
SRY
Yp11.31
n/a
240-252.5
verde
XHPRT
Xq26.2
0,72
260,5-304.5
verde
DXYS218
Xp22.32/Yp11.3
0,74
367,5-402.5
verde
SY84
Yq11.1 (221)
n/a
323-333
giallo
SY86
Yq11.21 (221)
n/a
312-322
giallo
SY127
Yq11.223
n/a
267-277
giallo
SY134
Yq11.223
n/a
297-308
giallo
SY254
Yq11.23 (223)
n/a
375-386
giallo
SY255
Yq11.23 (223)
n/a
118-128
giallo
ZFX/Y
Xp22.11/Yp11.2
n/a
485-495
giallo
MFI-Yplus
Marker
Posizione
Intervallo bin (bp)
Colorante marker
SY82
Yq11.21
260-268
blu
SY83
Yq11.21
270-280
blu
SY88
Yq11.221
118-128
blu
SY105
Yq11.222
291-305
blu
SY121
Yq11.222
180-200
blu
SY143
Yq11.223
305,5-315
blu
SY153
Yq11.223-Yq11.23
134-144
blu
SY160
Yq12
231-241
blu
SY1182
Yq11.221
242-252
blu
SY1191
Yq11.223
375-395
blu
SY1291
Yq11.223
517-537
blu
*Le eterozigosità osservate sono basate sul numero di alleli osservati con il pannello di test di Elucigene
Diagnostics. Pertanto questi numeri possono differire dai dati pubblicati a seconda della popolazione
sottoposta ai test
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Posizione dei marker STS di microdelezione del cromosoma Y usati per i prodotti
Male Factor Infertility
Regione
Marker STS
AZFa
SY82
AZFa
SY84
AZFa
SY86
AZFa
SY1182
AZFa
SY88
AZFb
SY105
AZFb
SY121
AZFb
SY127
AZFb
SY134
AZFb
SY143
AZFc gr/gr
SY1191
AZFb
SY153
AZFc
SY254
AZFc
SY254
AZFc
SY254
AZFc
SY254
AZFc gr/gr
SY1291
AZFb
SY153
AZFc
SY254
AZFc
SY254
AZFc
SY254
Terminale
SY160
Inizio STS
Fine STS
Sono state recuperate coordinate genomi da MSY Breakpoint Mapper (breakpointmapper.wi.mit.edu)
basate su NCBI Build 38
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APPENDICE 3: Profilo GeneMapper
Profilo maschile normale GeneMapper che mostra le posizioni dei marker rilevati da Male Factor
Infertility.
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Profilo maschile normale GeneMapper che mostra le posizioni dei marker rilevati da MFI-Yplus.
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Caratteristiche prestazionali
Convalida interna
24 campioni di DNA (estratti da sangue pieno) sono stati sottoposti a test cieco utilizzando il test
Elucigene Male Factor Infertility. 1 campione non ha prodotto amplificazione a causa di scarsa
concentrazione e qualità del DNA. Dei campioni che hanno prodotto risultati interpretabili, 9 erano
normali, 2 presentavano una microdelezione nella regione AZFa, 6 presentavano microdelezioni in
AZFc e 6 presentavano delezioni più ampie che interessavano sia AZFb sia AZFc (AZFbc). Tutti i
risultati analizzabili hanno mostrato specificità e sensibilità al 100% con risultati ottenuti in precedenza
tramite un metodo stabilito alternativo.
Il test di estensione con Elucigene MFI-Yplus ha confermato la presenza di queste microdelezioni Y
nonché il rilevamento di varie subdelezioni, cioè delezioni gr/gr (AZFc parziale) in 2 campioni wild
type, una delezione parziale AZFa in un campione AZFbc e perdita del marcatore terminale SY160 in
5 campioni AZFbc evidenziando una delezione terminale Yq maggiore.
Convalida esterna
25 campioni sono stati testati presso un ente esterno utilizzando Elucigene Male Factor Infertility. 20
di questi campioni testati come maschili. Di questi campioni, 12 sono stati testati come wild type per
la microdelezione del cromosoma Y, 2 testati positivi per microdelezioni di AZFa, 1 di AZFb, 1 di
AZFc, 3 di AZFbc e 1 per una microdelezione nella regione AZFabc. Tutti i risultati analizzabili hanno
mostrato specificità e sensibilità al 100% con risultati ottenuti in precedenza tramite un metodo
stabilito alternativo.
Un campione sembrava dimostrare una perdita del picco SY86 (marker della regione AZFa) mentre
ha mostrato 2 picchi nel marker SY134 (marker della regione AZFb). Questo risultato è probabilmente
la conseguenza di una delezione piccola (ca. 19bp) che interessa l'amplicone SY86 e che comporta
la migrazione di questo prodotto PCR nel marker bin confinante SY134 su elettroforesi capillare
(vedere la Guida all'analisi per un esempio).
Limiti della procedura
Questo test è concepito per l'individuazione di aneuploidie del cromosoma sessuale nonché delezioni
specifiche del cromosoma Y, come specificato nelle Istruzioni per l'uso. Potrebbe non rilevare
riassetti strutturali che coinvolgono i cromosomi sottoposti a test e non rileverà anomalie presenti in
altri cromosomi. Il mosaicismo per i cromosomi sottoposti a test potrebbe non essere rilevato.
Nota: Gli eterozigoti dei marker utilizzati derivano da una serie casuale di campioni sottoposti ad
analisi di routine di una popolazione caucasica prevalentemente nord europea. Ogni calcolo che
utilizza questi eterozigoti è applicabile unicamente alla popolazione da cui i campioni sono stati
prelevati. Un piccolo studio che utilizza campioni di origine locale può essere effettuato nell'ambito di
uno studio di convalida al fine di stabilire gli eterozigoti nella popolazione da sottoporre a test. Non è
previsto che la variazione delle popolazioni alteri notevolmente il livello informativo generale del test.
Ulteriori dettagli sui prodotti di Elucigene sono disponibili sul sito:
http://www.elucigene.com
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Referenze
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Medical Journal 2009 Apr;50(4): 336-47
Krausz C, Hoefsloot L, Simoni M, Tuttelmann F, European Academy of Andrology, European
Molecular Genetics Quality Network. EAA/EMQN best practice guidelines for molecular diagnosis
of Y-chromosomal microdeletions: state-of-the-art 2013. Andrologia 2014 (2) 1 5 -19
Mansfield E S. Diagnosis of Down syndrome and other aneuploidies using quantitative
polymerase chain reaction and small tandem repeat polymorphisms. Human Molecular Genetics
1993 2(1): 43-50
Mann K, Fox SP, Abbs SJ, Yau SC, Scriven PN, Docherty Z, Mackie Ogilvie C. Development and
implementation of a new rapid aneuploidy diagnostic service within the UK National Health
Service and implications for the future of prenatal diagnosis. The Lancet 2001 358 (9287): 10571061
Mann K, Donaghue C, Fox SP, Docherty Z, Mackie Ogilvie C. Strategies for the rapid prenatal
diagnosis of chromosome aneuploidy. European Journal of Human Genetics 2004 12: 907-915
Mackie Ogilvie C, Donaghue C, Fox SP, Docherty Z, Mann K. Rapid prenatal diagnosis of an
aneuploidy using Quantitative Fluorescence-PCR (QF-PCR). Journal of Histochemistry and
Cytochemistry 2005 53(3): 285-288
Deutsch S, Choudhury U, Merla G, Howald C, Sylvan A, Antonarakis SE. Detection of
aneuploidies by paralogous sequence quantification. European Journal of Human Genetics 2004
41: 908-915
Simoni M, Bakker E, Krausz C. EAA/EMQN best practice guidelines for molecular diagnosis of ychromosomal microdeletions. State of the art 2004. International Journal of Andrology 2004
27:240-9
Satsangi J et al. Effect of heparin on polymerase chain reaction. +44 (343) 1509 -1510 1994
PCR Primer: A Laboratory Manual, 2nd edition. ColdSpring Harbour Laboratory Press: Section 1
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Avviso per l'acquirente: Licenza limitata
Questo prodotto è venduto in conformità con un accordo con la società Life Technologies
Corporation. L'acquisto di questo prodotto trasferisce all'acquirente il diritto non trasferibile di utilizzare
solo la quantità acquistata del prodotto e dei suoi componenti esclusivamente per uso diagnostico in
vitro, unicamente per l'indicazione clinica descritta nelle istruzione per l'uso allegate al prodotto. Per
informazioni relative all'ottenimento di ulteriori diritti di utilizzare questo prodotto o i suoi componenti,
contattare [email protected].
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