Amplificazione PCR del gene RHD di un

Amplificazione PCR del gene RHD di un soggetto Rhnull
regolatore, allargata al nucleo familiare
Adelina Ornella Perrone
Servizio di Immunoematologia e Medicina Trasfusionale, ASL 1 Imperiese, Imperia
(Responsabile: Dott. Tommaso Castelli)
Here are reported the results of a research about
RHD genotyping made whit four different PCR methods
on DNA samples from a family transmitting a regulator
Rhnull disease gene, previously described.
We show that the RHD gene is present in sample of
DNA come from propositus Rh null and from
consanguineous serotyped as RhD positive, but is
absent in consanguineous serotyped as RhD negative.
We reaffirm the necessity of using primers which
are long enough and to apply at the same time more
methods in RHD gene detection.
We underline that the phenotype RhD negative in
some cases does not correspond to the absence of
related gene: the Rh system is really complex and its
expression depends on several factors, some are
strongly related to Rh locus, some are due to different
genetic loci.
Parole chiave: Rhnull"regolatore", analisi gene RHD
Key words: Rhnull regulator type, RHD gene analysis
Introduzione
Gli antigeni Rh sono codificati da due geni strettamente
correlati: RHD ed RHCE, situati sul braccio corto del
cromosoma 1 alle posizioni p34-p36. Ciascun gene è
organizzato in 10 esoni distribuiti su 75 kb di DNA; le
rispettive sequenze nucleotidiche sono omologhe al 96%.
Il gene RHD codifica la specificità dell'antigene D, il gene
RHCE controlla la sintesi degli antigeni C, c, E, e , nelle
diverse combinazioni alleliche, ce; cE; Ce; CE1-8.
Ricevuto: 21 febbraio 2000 - Accettato: 29 marzo 2000
Corrispondenza:
Adelina Ornella Perrone
Via Andrea Doria, 3
18017 San Lorenzo al Mare (IM)
L'alto grado di omologia tra le regioni codificanti dei
geni RHD e RHCE fa ipotizzare la loro origine dalla
duplicazione di un unico gene ancestrale9.
Il gene RHD di norma è assente nei soggetti Rh negativi
(15% della popolazione caucasica) che possiedono, perciò,
solo il gene RHCE. Nella popolazione non caucasica,
tuttavia, è stata rilevata un'alta frequenza di soggetti con
fenotipo RhD negativo e genotipo RHD positivo, per i quali
si ipotizza che il gene RHD sia intatto ma inattivo a causa di
mutazioni o crossing-over10-12.
Le proteine Rh, palmitolate, di peso molecolare
compreso tra 30 e 32 kDa13,14, sono costituite da 417
aminoacidi ed organizzate in 12 domini che attraversano la
membrana eritrocitaria, regolarmente spaziati e collegati tra
loro da occhielli (loops) idrofilici extramembrana8 .
L'espressione della loro attività antigenica è
condizionata dalla formazione di un complesso con alcune
proteine glicosilate, RhAG (Rh-associated glycoprotein)
prodotte dal gene RHAG, situato sul braccio corto del
cromosoma 6 alle posizioni p11-p21.1, formato da 10
esoni,con struttura esone/introne simile a quella dei geni
Rh, con i quali è omologo al 36%.
Le proteine RhAG, formate da 409 aminoacidi, di peso
molecolare compreso tra 36-55 kDa, organizzate in 12 domini
transmembrana, simili alle proteine Rh, appartengono alla
stessa famiglia. Entrambe sono espresse unicamente nelle
linee eritrocitarie e megacariocitiche. Si ipotizza che Rh ed
RhAG siano differenti subunità di un complesso oligomerico
che avrebbe la funzione di trasporto o di canale per gli ioni
NH4+15,16.
Riguardo alla nomenclatura relativa agli antigeni Rh ed
Rh AG, da alcuni Autori denominati rispettivamente Rh30
ed Rh5017 in base al peso molecolare delle proteine isolate,
sono necessarie delle precisazioni per le quali si rimanda
alla rassegna sulle nuove acquisizioni sul sistema Rh18.
Qui si ricorda che la nomenclatura immunoematologica ha
LA TRASFUSIONE DEL SANGUE vol. 45 - num. 5 settembre - ottobre 2000 (253-259)
253
AO Perrone
Figura 1: studio familiare di soggetto Rhnull di tipo"regolatore"
indicato da tempo con la sigla "Rh30" l'antigene Gonzales
e con la sigla "Rh50" un antigene a bassa incidenza, FPTT,
correlato a fenotipi RhD parziali19,20. Oltre all'RhAG, altre
glicoproteine concorrono alla espressione del sistema Rh:
CD47, LW e glicoforina B. Quest'ultima porta le specificità
Ss ed U del sistema gruppoematico MNSsU8.
Gli antigeni Rh, RhAG e CD47 rivestono un ruolo
cruciale per conferire integrità alle membrane eritrocitarie;
la loro assenza o riduzione è associata alla sindrome Rhnull
(Rhnull disease) caratterizzata da anemia emolitica di vario
grado, stomatocitosi, sferocitosi e fragilità osmotica21,22. Il
fenotipo Rhnull è caratterizzato dalla totale assenza
dell'espressione fenotipica degli antigeni Rh: la ricerca
sierologica, sia diretta che mediata da tecniche di
assorbimento ed eluizione, citometria o Western blot, non
rileva gli antigeni D, C, c, E, e, mentre gli antigeni correlati,
ossia LW, U, Fy5, CD47, sono assenti o assai ridotti. Alla
base ci sono due meccanismi genetici: il tipo" regolatore" è
dovuto all'azione di un gene regolatore-soppressore portato
da un locus diverso dal locus RH23,24 mentre il tipo "amorfo"
è dovuto a delezioni o mutazioni proprie del locus RH25,26.
Il fenotipo Rhmod, che presenta sierologicamente tracce
di antigeni Rh, in analogia con il tipo "regolatore" appare
controllato da un gene autosomico soppressore8. Sono state
pubblicate numerose ricerche sulle basi molecolari di tali
fenotipi, alcune descritte nella rassegna già citata18; qui si
riassumono alcuni dati fondamentali .
Il tipo amorfo avrebbe origine in alcuni casi da una
larga delezione del locus RH, in altri casi da mutazioni o
delezioni dell'unico gene RHCE presente in soggetti RhD
254
negativi26,27. Nel tipo regolatore, invece, i geni RHD ed
RHCDE appaiono generalmente presenti e intatti, mentre il
locus RHAG risulta alterato: delezioni, sostituzioni di basi
o produzione di RNAm non maturo darebbero origine ad
una proteina RhAG anomala.
Le proteine Rh, sebbene normali, non avrebbero la
possibilità di collegarsi o di essere trasportate dall'RhAG
sulla membrana e non sarebbero rilevate dalle ricerche
anticorpali16,17, 28. Il tipo Rhmod rifletterebbe sia l'incompleta
penetranza delle mutazioni del gene RHAG che altre
mutazioni sconosciute16.
Un fenotipo Rhnull è stato individuato presso il Centro
Trasfusionale di Imperia in una donna di origine calabrese29.
La determinazione di gruppo sanguigno e l'analisi completa
del fenotipo Rh, evidenziavano l'assenza di tutti gli antigeni
Rh. La ricerca degli antigeni Rh, estesa in ambito familiare
con l'applicazione di tecniche di assorbimento ed eluizione,
e lo studio della trasmissione del carattere X°r, consentivano
di attribuire l'assenza di espressione degli antigeni Rh al
tipo "regolatore" (Figura 1).
L'analisi sierologica evidenziava una ridotta espressività
degli antigeni Rh nei genitori, nei figli, in uno zio paterno e
in una zia materna della proposita, mentre il fratello ed una
zia paterna presentavano normali espressioni antigeniche
Rh. Si consolidava l'ipotesi della presenza di un gene
regolatore/soppressore diverso dal locus RH, che inibisce
l'espressione del locus RH, espresso allo stato omozigote
nella donna (X°r/X°r) ed allo stato eterozigote (X1r/X°r) nei
genitori e nei figli.
La paziente presentava all'anamnesi una lieve forma di
Amplificazione PCR gene RHD in Rhnull
Tabella I: oligonucleotidi usati nel metodo di amplificazione
secondo Bennett et al.31
Primer Esone
A1
A2
A3
A4
7
7
10
10
Sequenza
oligonucleotidica
Prodotto
atteso
5’-TGTGTTGTAACCGAGT-3’
5’-ACATGCCATTGCCG-3’
5’-TAAGCAAAAGCATCCAA - 3’
5’-ATGGTGAGATTCTCCT - 3’
136bp
186bp
anemia normocitemica, con valori di ematocrito ed
emoglobina inferiori alla norma, diminuita resistenza
osmotico-globulare, lieve splenomegalia, in prima istanza
attribuite all'anemia mediterranea.
La tipizzazione elettroforetica della emoglobina e
soprattutto il riscontro del particolare fenotipo
consentivano di inquadrare più correttamente la
sintomatologia con la sindrome da Rhnull (Rhnull disease). I
soggetti Rhnull producono frequentemente alloanticorpi:
infatti, la maggior parte dei casi è stata individuata proprio
in seguito al riscontro di anticorpi a specificità anti-Rh (total
RH o Rh29). Le trasfusioni e le gravidanze sembrano essere
eventi molto sensibilizzanti.
Nel caso specifico, non sono stati riscontrati anticorpi
irregolari, che però potrebbero essere presenti a titolo
estremamente basso e, quindi, indosabile, poiché la donna
ha avuto due figli che sono già adulti. Per cautelarsi
sull'eventualità di ricevere in futuro trasfusioni di sangue
verso il quale potrebbe immunizzarsi, il soggetto ha aderito
ad un programma di predeposito periodico di sangue
autologo che viene congelato.
Inoltre, una unità di sangue è stata donata dalla donna
ad una piccola paziente affetta da grave anemia emolitica
autoimmune per la quale solo questo particolare tipo di
sangue risultava compatibile.
È stata eseguita una ricerca preliminare di
genotipizzazione con tecnica di polimerizzazione a catena
(PCR)30 secondo una metodica proposta da Bennett et al.31,
che non ha rilevato la presenza del gene RHD. La metodica
prevedeva l'uso di 4 primers (A1, A2, A3, A4), la cui
composizione è riportata in tabella I.
Poiché è stata riportata la possibilità di non rilevare il
gene RHD utilizzando sequenze oligonucleotidiche corte3235
e per estendere lo studio al nucleo familiare del soggetto,
si è dato corso ad una indagine di genotipizzazione RHD
con metodi diversi 12 che utilizzano sequenze
oligonucleotidiche più lunghe collocate nella regione a più
alta divergenza tra i geni RHD ed RHCE, in particolare
l'esone 10 (metodo I), l'esone 7 (metodo II), l'esone 4 (metodo
III) e l'introne 4 (metodo IV).
I risultati vengono riportati nella pertinente sezione.
Materiali e metodi
Campioni di sangue periferico, raccolti in EDTA, del
soggetto Rhnull e del suo nucleo familiare, che presentava i
seguenti fenotipi: padre(CcDee), madre(ccdee), figlia
(CcDee), figlio (CcDee), marito (CcDee). Campioni di
controllo RhD negativi e positivi, dei seguenti
fenotipi:ccdee, CcDEe, CCDee,ccDEE, ccDee, ccDuee.
I linfociti sono stati separati in gradiente di Ficoll, l'anello
linfocitario è stato lisato per ricavarne il DNA con il kit di
estrazione Total DNA Extra Kit della Ditta GENEDIA
(Lucca). Il metodo prevede la lisi cellulare tamponata ad
opera di tensioattivi, la degradazione enzimatica delle
proteine, l'allontanamento dei sali, dei tensioattivi e dei
frammenti peptidici derivanti dalla degradazione proteica
ed il recupero del DNA nel volume prescelto. Dopo
l'estrazione, i campioni sono stati conservati a –20 °C fino
al momento dell'analisi. Il DNA è stato dosato
quantitativamente con misura spettofotometrica a 260 nm.
Il campione è stato misurato, inoltre, a 280 nm per valutare
il rapporto DO260/DO280, che fornisce una stima della
purezza dell'acido nucleico in soluzione. Preparazioni pure
di DNA hanno un rapporto ottimale di 1,8. In presenza di
contaminazione proteica, il rapporto si abbassa, mentre si
alza per interferenze dovute all'RNA. È stata calcolata la
diluizione ottimale del campione, tenendo conto che una
quantità troppo elevata di DNA può diminuire l'efficienza
della reazione per la presenza di contaminanti, mentre una
quantità troppo scarsa può aumentare la probabilità di
amplificare prodotti non specifici. Il campione è stato
risospeso in acqua distillata in modo da ottenere la
concentrazione finale di 1 mg di DNA genomico in un totale
di 10 mL. L'allestimento della tecnica PCR è stato effettuato
secondo quattro metodi diversi: I-II- III-IV12. I primers usati,
descritti in tabella II, sono derivati dall'amplificazione
selettiva di specifiche sequenze D, basate su nucleotidi
conosciuti dei geni RHD ed RHCDE36-38,33. L'oligonucleotide
D4 deriva dal primer A3 descritto da Bennett et al.31, esteso
in 5' con l'aggiunta di sei basi addizionali. Tutti i metodi,
secondo quanto riportato in letteratura, hanno un'alta
specificità: uno stampo di DNA RHD positivo può essere
captato in presenza di un largo eccesso di cellule RHD
negative. Dopo prove preliminari effettuate variando la
temperatura di ibridazione, la concentrazione di ioni Mg e
gli enzimi DNA polimerasi, sono state impostate le
condizioni ritenute ottimali per testare in parallelo i metodi
I, II, III. Nel metodo IV, a 45 °C comparivano tutte le bande
di amplificazione, ma erano aspecifiche. A 53 °C compariva
solo la banda 1200 bp (assente nel controllo negativo).
Alzando la temperatura di ibridazione, per aumentare la
specificità, tutte le bande risultavano assenti.
255
AO Perrone
Tabella II: oligonucleotidi usati in quattro diversi metodi PCR secondo Aubin et al.12
Metodo
Primer
Esone
Sequenza oligonucleotidica
I
D4 (nt 1246 – 1271)
D5 (nt 1536 – 1516)
10
10
5’-GGATTTTAAGCAAAAGCATCCAAGAA – 3’
5’-ACTGGATGACCACCATCATAT – 3’
291bp
II
D6 (nt 936 – 956)
D7 (nt 1068 – 1048)
7
7
5’-acagGGGTGTTGTAACCGAGT – 3’
5’- ATTGCCGGCTCCGACGGTATC – 3’
133bp
III
D8 (nt 495 – 514)
D9 (nt 602 – 621)
4
4
5’ –CCACATGAACATGATGCACA – 3’
5’ – CAAACTGGGTATCGTTGCTG – 3’
127bp
IV
P10 (nt 607 – 624)
P11 (nt 768 – 751)
4
5
5’ – ACGATACCCAGTTTGTCT – 3’
5’ – TGACCTGAGATGGCTGT – 3’
1200bp (CE)
600bp (D)
Tabella III: risultati della genotipizzazione RhD con i
metodi I – II - III di Aubin et al.12
Met I
(esone 10)
291bp
Met II
(esone 7)
133bp
Met III
(esone 4)
127bp
ccdee
-
-
-
CcDEe
+
+
+
CCDee
+
+
+
ccDEE
+
+
+
+
+
+
Rhnull (proposita)
+
+
+
CcDee (padre)
+
+
+
ccdee (madre)
-
-
-
CcDee (marito)
+
+
+
CcDee (figlia)
+
+
+
CcDee (figlio)
+
+
+
ccD ee
Nucleo familiare
Il saggio è stato allestito quindi nelle condizioni di
seguito descritte.
Miscela di reazione (totale: 50 mL):
H2O
27,75
Tampone
5
DNTPs (10 millimolare)
1
Primer A
1
Primer S
1
MgCl2 25Mm
4
TAQ platinum (5 unità/mL)
0,25
Campione (contenente 1 mL di DNA genomico)
10
Protocollo del termociclatore:
94°C
5min
95°C
1min
50 °C 2 min
72 °C 2 min
92°C
1min
50 °C 1 min
72 °C 1 min
72°C 10 min
256
La rivelazione delle bande di amplificazione è stata
effettuata in gel di agarosio al 2% contenente bromuro di
etidio.
Risultati
Gruppo di controllo
u
Prodotto atteso
2 cicli
38 cicli
Si riportano in tabella III i risultati ottenuti
dall'amplificazione con tecnica PCR. Con i metodi I-II-III
sono stati riscontrati risultati conformi all'atteso in tutti i
campioni classificati sierologicamente come RhD negativi
ed RhD positivi, nelle diverse varianti fenotipiche, ed anche
nel campione Du (che da studi sierologici e di trasmissione
familiare risultava di tipo "ereditario").
Con le template di DNA RHD positivo è stato
amplificato un prodotto RhD specifico rispettivamente di
291, 133, 127 paia di basi, mentre tale prodotto è risultato
assente con le template di DNA RHD neg.
Nel soggetto Rhnull erano presenti i prodotti di 291, 133,
127 bp che caratterizzano l'amplificazione del gene RHD.
Nel nucleo familiare la presenza o l'assenza della banda di
amplificazione è risultata conforme alla fenotipizzazione
sierologica, e precisamente il campione proveniente dalla
madre, di fenotipo ccdee, non forniva prodotti di
amplificazione, mentre quelli provenienti dal padre, dai due
figli e dal marito, classificati come Rh positivi, presentavano
tutte le bande tipiche dell'amplificazione del gene RHD.
Non è stato possibile ottimizzare il metodo IV in quanto,
nelle condizioni risultate più idonee per gli altri tre metodi,
non si rilevavano prodotti di amplificazione, sia nei controlli
Rh negativi e positivi, sia nei campioni del nucleo familiare.
Variando i parametri di amplificazione, le bande
risultavano presenti, ma aspecifiche, in tutti i campioni.
La sensibilità del metodo potrebbe essere inficiata dalla
competizione tra le due sequenze target RhD e RhCE.
Nelle Figure 2-3 sono riportate alcune immagini della
rivelazione elettroforetica.
Amplificazione PCR gene RHD in Rhnull
Figura 2: tracciato elettroforetico ottenuto dall’amplificazione con tecnica PCR , metodi I-II-III-IV: proposita, marito, figli
Campione 1 Rhnull proposita
Campione 2 Rh pos fenotipo CcDee marito
Campione 3 Rh pos fenotipo CcDee figlia
Campione 4 Rh pos fenotipo CcDee figlio
Campione 5 Rh neg fenotipo ccdee controllo
M: marcatore di peso molecolare
B: bianco
Tabella IV: risultati della genotipizzazione RhD con il
metodo Bennett et al.31
Campioni
Esone 7
136bp
Esone 10
186bp
Fenotipo RhD neg
+
-
Fenotipo RhD pos
+
+
Fenotipo Rhnull
+
-
Discussione
Le metodiche proposte, oltre che per caratterizzare la
prevalenza del gene RHD e delle sue varianti nella
popolazione, sono utilizzate per determinare le
contaminazioni materno-fetali al fine di prevenire la MEN;
sono perciò ottimizzate per ottenere una grande sensibilità.
La presenza del gene RHD è stata riscontrata anche in
soggetti di fenotipo RhD negativo, soprattutto nella
popolazione africana, suggerendo l'ipotesi che questi
soggetti abbiano il gene largamente intatto ma inattivo per
mutazioni o riarrangiamenti e che l'espressione fenotipica
nella popolazione asiatica ed africana sia assai complessa.
Nel soggetto di fenotipo Rhnull qui descritto, gli studi
preliminari, effettuati secondo il metodo di Bennett et al.31,
non avevano evidenziato il prodotto di amplificazione di
186 paia di basi che era presente nei controlli RHD positivi
ed assente nei controlli RHD negativi (Tabella IV). Si
formulano due ipotesi: gli oligonucleotidi utilizzati nel
saggio erano troppo corti ed avevano fornito un falso
risultato negativo,come si riporta anche in letteratura
oppure esiste una mutazione genetica a livello della
giunzione non espressa dal primer A3, che ha bloccato la
rilevazione del prodotto di amplificazione.
Si sta indagando con tecniche alternative per rilevare
eventuali mutazioni presenti nell'isolato39.
La presenza del gene RHD nel soggetto Rhnull è stata
riscontrata con i metodi I, II, III secondo Aubin et al.12.
Nel nucleo familiare, la presenza o l'assenza dei prodotti
di amplificazione del gene RHD è risultata conforme alla
fenotipizzazione sierologica.
Alcune ricerche su soggetti Rhnull di tipo "regolatore" e
Rhmod hanno riscontrato normali sequenze a livello dei geni
RH e difetti molecolari nei geni RHAG16,17,28.
Il gene RH di norma esprime un prodotto maturo e
regolare, il gene RHAG non esprime la sua proteina o la
produce modificata, con una struttura che impedisce il
collegamento o il trasporto degli antigeni Rh sulla membrana
cellulare.
Nei soggetti Rhnull "amorfi", invece, i difetti molecolari
descritti 26,27 sono stati riscontrati a carico del locus RH: il
gene RHD è assente, il gene RHCE presenta mutazioni o
delezioni , oppure intervengono errori di trascrizione a cui
257
AO Perrone
Figura 3: tracciato elettroforetico ottenuto dall’amplificazione con tecnica PCR, metodi I – II – III: proposita, genitori
Campione 1 Rh neg. fenotipo ccdee madre
Campione 2 Rh pos. fenotipo CcDee padre
Campione 3 Rh neg. fenotipo ccdee controllo
Campione 4 Rh neg. fenotipo ccdee controllo
Campione 5 Rhnull proposita.
M: marcatore di peso molecolare.
B: bianco.
consegue la mancata produzione di antigeni Rh normali, il
gene RHAG è normale e codifica proteine RhAG normali.
Nel caso proposto, il gene RHD è risultato presente, la
trasmissione del carattere R1 in ambito familiare è conforme
a quanto avviene nel fenotipo Rhnull "regolatore", per cui,
senza escludere la possibilità che ci siano mutazioni a carico
del gene RHD che comunque risulta presente (e non
assente come nei fenotipi Rhnull "amorfi"), si ipotizza la
presenza di mutazioni a carico del locus RHAG.
eventuali mutazioni a carico degli acidi nucleici e le
conseguenti modificazioni a livello delle proteine. Si intende
cercare un contatto con istituti di ricerca che abbiano la
possibilità di disporre di tecnologie adeguate per poter
approfondire la ricerca, sia per individuare nel soggetto
Rhnull e nel suo nucleo familiare analogie o differenze rispetto
ad altri casi riportati in letteratura, e contribuire alla
individuazione delle varianti fenotipiche, sia per classificare
al meglio il codice genetico di un tipo di sangue assai raro,
per il quale si stima una frequenza di un caso ogni 6 milioni40.
Conclusioni
Riassunto
Si ribadisce la nota complessità del sistema Rh, la cui
espressione dipende da numerosi fattori: alcuni
strettamente correlati al locus RH, altri dipendenti da loci
genetici diversi. Mutazioni, delezioni, riarrangiamenti a
livello genico, errori di trascrizione dell'RNAm, possono
causare difetti nella produzione delle proteine fondamentali
per la costituzione del sistema Rh. Nel soggetto in esame, il
gene RHD è risultato presente, la trasmissione del carattere
in ambito familiare, tipica del fenotipo Rhnull "regolatore", fa
ipotizzare che, come per altri casi descritti in letteratura, il
locus RH sia normale e ci siano delle variazioni molecolari a
carico del locus RHAG. Si individua la necessità di estendere
l'indagine ai geni RHCE ed RHAG ed analizzare le sequenze
esoniche/introniche del DNA e l'RNAm retrotrascritto in
cDNA, nonché le proteine che ne derivano, per individuare
258
Si descrivono i risultati di una ricerca del gene RHD
effettuata con quattro diversi metodi di amplificazione
PCR su campioni di DNA provenienti dal nucleo familiare
di un soggetto di fenotipo Rhnull "regolatore" già oggetto
di precedenti indagini. Il gene RHD è risultato presente
nei campioni di DNA provenienti dal soggetto Rhnull ed in
quelli appartenenti ai familiari di fenotipo RhD positivo,
mentre è risultato assente nei consanguinei di fenotipo
RhD negativo. Si ribadisce la necessità di utilizzare
oligonucleotidi sufficientemente lunghi e di applicare
contemporaneamente più metodi nelle ricerche di
genotipizzazione RHD. Si sottolinea come all'espressione
fenotipica RhD negativa non sempre corrisponda
l'assenza del relativo gene:il sistema Rh risulta
Amplificazione PCR gene RHD in Rhnull
particolarmente complesso e la sua espressione dipende
da numerosi fattori, alcuni strettamente correlati al locus
RH, altri dipendenti da loci genetici diversi.
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