Micropropagazione

Prunus persica…
I problemi legati alla propagazione in vitro del pesco, spesso, dipendono dall’iperidricità dei tessuti.
In questo caso si utilizza il sistema ad immersione tempoanea. Due bottiglie di vetro sono connesse da
un tubo di silicone, una bottiglia contiene gli espianti su un supporto di biglie di vetro che garantiscono
l’isolamento dal terreno di coltura durante il periodo di non immersione, la seconda bottiglia contiene il
terreno di coltura.
Il terreno viene trasferito da una bottiglia all’altra grazie alla pressione creata da una pompa ad aria,
l’aria spinta nella bottiglia passa attraverso un filtro sterile.
Con questo metodo le piante sono in contatto con il terreno per un breve periodo, sufficiente a
stimolare lo sviluppo e la crescita. La rimozione del terreno previene l’accumulo di etilene.
Prunus dulcis…
Nella micropropagazione del mandorlo il problema principale è la necrosi degli apici.
In questo caso la modificazione dei protocolli e, in particolare, del tempo di subcoltura è stato
fondamentale. Infatti un periodo lungo (> 20 giorni) causava la necrosi degli apici.
Subcolture di 20 - 25 giorni
Subcolture di 12 -15 giorni
SISTEMI DI RIGENERAZIONE
L’accrescimento dell’apice meristematico interviene quando il meristema apicale di un’ estremità del
germoglio viene fatto radicare per la produzione di una plantula. Tale procedura viene impiegata
principalmente per ottenere piante esenti da virus, nelle quali solo il meristema apicale (0,5mm) è
rimosso assieme a poche foglie sottostanti.
I punti laterali di crescita sui nodi dell’espianto, sotto il meristema apicale, sono stimolati a crescere,
mentre viene inibito il meristema apicale stesso. La crescita dei germogli ascellari provoca un
processo di rapida moltiplicazione, nel quale il numero di piante potenziali, ad ogni ripetizione,
aumenta esponenzialmente.
Induzione diretta di germogli avventizi su radici, foglie, bulbi ed altri organi. Questi possono
svilupparsi sia direttamente dall’espianto sia indirettamente da masse di tessuto calloso indifferenziato.
L’organogenesi si riferisce alla produzione sia di germogli avventizi che di radici da cellule entro
masse callose. Queste masse cellulari possono sviluppare meristemoidi che producono organi in
particolari condizioni colturali. Simile al precedente ad eccezione del periodo necessario alla crescita
del callo.
Cellule cresciute in coltura in sospensione, con particolari nutrienti e ormoni, possono sviluppare
milioni di embrioni individuali. Queste strutture sono chiamate embrioni somatici.
SOSPENSIONI CELLULARI
Sistemi di coltura di tessuti e di cellule. La coltura di cellule vegetali sia come tessuto calloso, che
come sospensione liquida è un importante tecnica preliminare alla rigenerazione dell’intera pianta.
Tuttavia, a causa della possibile variabilità genetica insita nel sistema, questo tipo di coltura ha più
significato nell’attività di miglioramento genetico.
Cellule cresciute in coltura in sospensione, con particolari nutrienti e ormoni, possono sviluppare
milioni di embrioni individuali. Queste strutture sono chiamate embrioni somatici.
Mediante tale processo cellule somatiche si sviluppano gradualmente in piante attraverso gli stadi
embriologici caratteristici, senza la fusione dei gameti.
Tale processo implica la formazione di strutture bipolari provviste sia di apice radicale che di apice
caulinare indispensabili al normale sviluppo della plantula. A partire dallo stadio globulare, è possibile
osservare la progressione della polarità attraverso uno stadio a cuore, a torpedo fino alla formazione
dei cotiledoni e la completa differenziazione della plantula.
ORGANOGENESI
Durante l’organogenesi appaiono talvolta dei cloni diversi dalle linee parentali: sono delle varianti
somatiche (variabilità somaclonale), che provengono da cambiamenti genetici nelle cellule dei
meristemi (modificazione del numero dei cromosomi nel nucleo, mutazioni a livello di alcuni loci
genici, cambiamenti a livello dei geni extranucleari nei cloroplasti o nei mitocondri, cambiamenti
epigenetici). Molte varietà coltivate derivano da varianti somatiche: il pompelmo rosa, il mandarancio,
la pesca nettarina (o nocepesca). Questa tecnica è ampiamente utilizzata in floricoltura.
ORGANOGENESI
Il mezzo di coltura dovrà indurre una dedifferenziazione delle cellule specializzate in modo da far
riacquistare la capacità meristematica o embriogenetica.
ORGANOGENESI
ORGANOGENESI DIRETTA
E' una metodologia volta all'ottenimento di germogli o radici, direttamente da tessuti messi in coltura,
senza passare attraverso le fasi di callo. L'assenza di proliferazione disorganizzata assicura una discreta
stabilità genetica.
La capacità di rigenerazione diretta è caratteristica di un numero ristretto di specie e limitato ad alcuni
tessuti. Ogni specie necessita di un determinato apporto di sostanze specifiche e concentrazioni ottimali
di ormoni. L'induzione e la crescita di germogli è generalmente favorita da un rapporto
citochinine/auxine a favore delle prime.
ORGANOGENESI INDIRETTA
Tessuti organizzati come foglie, radici, fusti ecc... perdono la loro struttura specializzata per accrescersi
sottoforma di un ammasso di cellule disorganizzate. L'induzione e la crescita del callo è favorito dalla
presenza nel mezzo di coltura di elevate concentrazioni di auxine e basse di citochinine. Ogni specie
necessita di un determinato apporto di sostanze specifiche e di particolari condizioni ambientali. Il
fenomeno dell'organogenesi può essere diviso in due fasi: la prima detta di induzione e la seconda di
determinazione. Durante la prima fase una o più cellule riacquistano la capacità di dividersi dando
origine a centri meristematici.
Nella seconda fase i centri meristematici acquistano una polarità indirizzandosi verso la formazione di
un apice radicale o apicale.
SELEZIONE DI GENOTIPI FAVOREVOLI
La grande variabilità genetica liberata dalle colture "in vitro" può essere sfruttata per il miglioramento
genetico delle piante coltivate, con il notevole vantaggio di lavorare in poco spazio su un altissimo
numero di genotipi differenti. Le procedure utilizzate per la selezione si basano sull'uso di sostanze o di
metaboliti ai quali possono sopravvivere solo mutanti resistenti. Ad oggi concreti risultati sono stati
ottenuti nella selezione di specie resistenti ad avversità biotiche ed abiotiche come elevate
concentrazioni di sali nel suolo, carenza idrica, tossine, molecole di pesticidi.
MARCATORI MOLECOLARI
Si utilizzano marcatori molecolari per monitorare complessi caratteri poligenici negli individui maturi
con genotipi superiori in termini di quantità e qualità della produzione (come altezza, forma della
chioma, qualità del legno o della frutta) e di risposta agli stress: vengono poi analizzati gli individui
giovani per gli stessi marcatori e quelli che presentano le caratteristiche desiderate vengono fatti
propagare.
L’impiego di marcatori di tipo ormonale e/o basati sull’espressione genica possono essere utili nella
propagazione degli alberi da frutta per identificare stadi e tessuti competenti per una propagazione
efficace su vasta scala di materiale esclusivo, certificato e garantito.
MIGLIORAMENTO GENETICO
Identificazione di marcatori molecolari
Selezione assistita
Identificazione di
genotipi
Organizzazione ed
evoluzione del genoma
vegetale
Approcci biotecnologici per manipolare tratti di interesse agronomico
Produzione di
legno
Qualità della frutta
Architettura
CONSERVAZIONE DELLA VARIABILITÀ GENETICA
Il rischio più grave della propagazione vegetativa è quello della diminuzione della variabilità genetica.
È dunque necessario, oltre al perfezionamento delle tecniche di produzione di massa di alcune specie di
piante, creare delle banche di geni per conservare i patrimoni ereditari indispensabili al mantenimento
della variabilità genetica.
Preservare piante legnose in campo richiede grandi terreni ed è molto costoso, la crioconservazione è
considerata l’alternativa alla conservazione a lungo termine del germoplasma vegetale.
Nella crioconservazione i processi metabolici, biochimici e di divisione cellulare sono arrestati.
Questo permette di conservare il materiale vegetale per lunghi periodi evitando deterioramento o
modificazioni.
FASI della CRIOCONSERVAZIONE
SCELTA DELL’ESPIANTO
Possono essere utilizzati diversi tipi di espianti: apici, cellule in sospensione, embrioni immaturi,
embrioni somatici, calli, gemme, peli radicali, semi, granuli pollinici.
I più utilizzati sono gli apici di 1-3 mm, per la loro stabilità genetica, il basso contenuto d’acqua e
l’alta percentuale di sopravvivenza.
PRETRATTAMENTO
Gli espianti sono inizialmente cresciuti per un breve periodo in un terreno arricchito di agenti
osmotici, questo abbassa il livello di acqua nei tessuti. In alcuni casi viene aggiunto a questi terreni
acido abscissico che riduce il tasso di crescita e sembra ridurre gli effetti negativi della deidratazione.
PROCEDURE CRIOGENICHE
Sono state messe a punto diverse procedure per portare i tessuti a una temperatura di circa -190°C, le
principali sono: two-step freezing, vitrification, encapsulation-dehydratation e encapsulationvitrification.
Two-Step Freezing
Questo metodo prevede un passaggio di raffreddamento lento a circa -30°C, seguito da un rapido
raffreddamento in azoto liquido. Richiede apparati di raffreddamento costosi e molte volte si ha la
formazione di ghiaccio durante la fase lenta.
Vitrification
Il materiale è trattato con una soluzione crioprotettiva (vitrification solution) nella quale il tessuto vivo
può essere raffreddato senza la formazione di ghiaccio. La soluzione esterna richiama acqua dalle
cellule e favorisce la deidratazione, le sostanze crioprotettive sono in quantità non tossiche ed hanno
pesi molecolari molto bassi che permettono una rapida penetrazione all’interno dei tessuti. La durata
del trattamento con la soluzione vitrificante è un parametro critico e avviene a circa 0°C. Il componente
più usato di questa soluzione è il DMSO (dimetilsolfossido).
Encapsulation-dehydratation
Questo metodo prevede l’incapsulazione del materiale vegetale in sfere di alginato di calcio. Le sfere
sono poi deidratate e successivamente raffreddate. Questa procedura è meno complicata e costosa
rispetto agli altri metodi e non prevede l’utilizzo di sostanze tossiche.
Encapsulation-vitrification
Questo metodo combina le tecniche di incapsulamento e vitrificazione. L’inclusione del materiale nelle
sfere riduce gli effetti tossici della soluzione di vitrificazione e aumenta quindi il tempo di esposizione
allo stress osmotico.
CRIOCONSERVAZIONE
Piante in
propagazione
INCAPSULAZIONE
+
OSMOTOLLERANZA
Terreno di
moltiplicazione
Alginato di sodio
3% (30 min)
1mm
apice
100 mM
CaCl2(30 min)
(24 ore)
Pretrattamento
0,75M Saccarosio
(24ore)
DISIDRATAZIONE
Riscaldamento
RICRESCITA
Silica-gel
Congelamento
rapido
(14 ore)
CRIOCONSERVAZIONE
CRIOCONSERVAZIONE
Panis et al. 2005
STABILITÀ GENETICA
Alcune tecniche prevedono l’uso del dimetilsolfossido come sostanza crioprotettiva, tuttavia si sospetta
che induca cambiamenti genetici.
Martins et al. 2004
STABILITÀ GENETICA
Fernández et al. 2002
STABILITÀ GENETICA
METILAZIONE DEL DNA
Boyko et al. 2007
Guo et al. 2007
Istituto Sperimentale per la Frutticoltura (Roma)
BIBLIOGRAFIA
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Martins M, Sarmento D and Oliveira MM (2004). Genetic stability of micropropagated almond plantlets, as assessed by RAPD
and ISSR markers. Plant Cell Rep 23: 492–496.
Panis B, Piette B and Swennen R (2004). Droplet vitrification of apical meristems: a cryopreservation protocol applicable to all
Musaceae. Plant Science 168: 45–55.
Shibli RA, Al-Ababneh SS and Smith MAL(2004). Cryopreservation of plant germplasm: a review. Agricultural science 31: 60-72.
Tutte le fotografie mancanti di referenza, le fasi di micropropagazione e di crioconservazione sono a cura
della sezione di propagazione dell’Istituto di Frutticoltura di Roma (CRA): Damiano C, Caboni E, Palombi
MA, Monticelli S, Gentile A, La Starza S, Frattarelli A, Condello E.