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Recettori accoppiati a proteine G (GPCR)
I recettori a sette domini transmembrana Alcuni argomenti trattati sono disponibili in formato PowerPoint al seguente indirizzo web: www.unipv.it/tslmra22 Forme di Signaling Cellulare (A) ENDOCRINO cellula endocrina (B) PARACRINO recettore cellula segnalatrice ormone cellule bersaglio mediatore locale Flusso sanguigno cellula bersaglio (C) NEUROCRINO (D) CONTATTO-DIPENDENTE sinapsi neurone cellula segnalatrice cellula bersaglio assone corpo cellulare neurotrasmetttore cellula bersaglio messaggero legato alla membrana (A) Gli ormoni prodotti dalle ghiandole endocrine sono secreti nel flusso sanguigno e possono essere distribuiti all’intero organismo. (B) I messaggeri paracrini sono rilasciati dalle cellule nel mezzo extracellulare e possono diffondere e agire localmente. (C) I segnali nervosi sono trasmessi lungo gli assoni a cellule bersaglio remote. (D) Il signaling contatto-dipendente richiede che le cellule siano a contatto l’una con l’altra membrana contro membrana. Le differenze cruciali tra le varie modalità riguardano la velocità e la selettività con cui I segnali sono trasmessi alle cellule bersaglio. Trasduzione del Segnale da Recettori di Superfice fattore di crescita ormone recettore accoppiato a proteina G via dell’AMPc via dell’IP3 recettore tirosin chinasi via del PI 3-kinasi citochina recettore per le citochine via delle MAP kinasi via del JAK-STAT Signalling mediante recettori accoppiati a proteine G recettore G proteina i q s t effettore canale enzima messaggero intracellulare Ca2+ cAMP Regioni Idrofobiche e idrofiliche dei lipidi di membrana Lipide di membrana Idrofobico Glicerofosfolipide Diacilglicerolo Alcool fosforilato Sfingomielina Ceramide Fosforilcolina Glicosfingolipide Ceramide Residui glucidici Colesterolo Anelli idrocarburici Gruppo OH di C3 Glicerofosfolipide Glicosfingolipide Colesterolo + Idrofilico = Anfipatico Lipidi di Membrana semplice organizzazione di molecole anfipatiche idrofilico idrofobico Lipidi di Membrana Sezione di un bilayer di glicerofosfolipidi Tutte le membrane biologiche sono bilayers lipidici Le proteine conferiscono proprietà uniche a ciascun tipo di membrana Proteine Acilate e Prenilate Acido palmitico acido grasso legato mediante legame estere a una Cys; aggiunto in fase post-traslazionale Esempi: recettore per l’insulina recettore beta-adrenergico rodopsina Acido miristico acido grasso legato mediante legame amidico a una Gly; aggiunto in fase co-traslazionale Esempio: subunutà a di proteina G (membrana plasmatica) Isoprenoide (farnesil;geranilgeranil) Isoprenoide legato mediante legame tioetere a una Cys vicina all’estremità C-terminale; aggiunto in fase post-traslazionale Esempio: subunutà g di proteina G (membrana plasmatica) Recettori accoppiati a proteine G (GPCR) siti di glicosilazione (legame tramite Asn) extracell. citosol ancoraggio lipidico siti di fosforilazione I Recettori Accoppiati a Proteine G (GPCR) rappresentano una famiglia di > 1000 membri strutturalmente correlati. Queste proteine sono anche chiamate Recettori a 7 Domini Transmembrana. Recettori Accoppiati a Proteine G 1. Hanno tutti 7 domini transmembrana (ad es. rodopsina) 2. Ci sono circa 1000 GPCRs nel genoma. (di molti di essi non si conosce ancora il ligando) 3. I singoli recettori rispondono a: un neurotrasmettitore come la serotonina o la dopamina, una piccola proteina (8-40 amminoacidi, un “peptide”) come le endorfine uno stimolo olfattorio la luce, nell’occhio Struttura Generale dei Recettori a 7 DT siti di glicosilazione (legame tramite Asn) extracell. ancoraggio lipidico dominio transmembrana citosol siti di fosforilazione Caratteristiche generali dei GPCRs comprendono: domini transmembrana ad a-elica, ancoraggio ai lipidi che ne stabilizza la conformazione, siti di fosforilazione citosolici che ne regolano l’attività, e siti di glicosilazione extracellulare che permettono l’interazione con molecole extracellulari e altre cellule. La Rodopsina è stato il primo membro della famiglia dei recettori a 7 DT ad avere la sua struttura determinata mediante cristallografia ai raggi-x Rodopsina PDB 1F88 Varie proteine interagiscono con I GPCR o Recettori a 7-DT per modularne l’attività Gli effetti di queste interazioni includono alterata affinità per il ligando, dimerizzazione del recettore che può aumentarne o alterarne l’attività, alterata localizzazione del recettore, ecc. RUOLO DELLA b-ARRESTINA NELLA REGOLAZIONE DEI RECETTORI ACCOPPIATI A G-PROTEINE legame del messaggero fosforilazione del recettore interazione con b-ARR associazione con CLATRINA Formaazione della vescicola endocitosi 1. Dopo un certo tempo che si è stabilito il legame dell’agonista al GPCR, una kinasi (GRK) fosforila alcuni residui aminoacidici intracellulari del recettore; 2. La fosforilazione porta a un disaccoppiamento del GPCR dalla G proteina (desensitizzazione) e al reclutamento della b-arrestina; 3. La b-arrestina a sua volta recluta molecole di clatrina; 4. Le molecole di clatrina favoriscono la formazione di una cavità da cui originerà la vescicola 5. La successiva endocitosi della vescicola provocherà l’internalizzazione del recettore. Le Proprietà dell’Internalizzazione definiscono due classi di GPCRs. Nel caso dei recettori di classe A (b2Adre), l’interazione b-arrestina–GPCR è transitoria, e la b-arrestina non si localizza con i GPCR negli endosomi. Per i recettori di classe B (Vaso2), l’interazione b-arrestina–GPCR è più stabile, e recettore e b–arrestina colocalizzano negli endosomi. Recettore di classe A Recettore di classe B vasopr adren Traffico Cellulare della barr2-GFP con i Recettori b2AR (adre) e V2R (vasopr) Cellule HEK-293 Co-transfettate con un plasmide contenente il cDNA per barr2-GFP e il cDNA per ciscun recettore Per visualizzare la barr2-GFP fluorescente in cellule prima e dopo il trattamento con agonista (10M Isoproterenol, 100nM AVP) Assenza di agonista, la barr2-GFP era omogeneamente distribuita nel citoplasma delle cellule che esprimevano b2AR o V2R. (0 min) Aggiunta di agonista, viene promossa la rapida redistribuzione dal citosol alla membrana plasmatica. (2 min) Una esposizione piu prolungata all’ agonista produceva una marcata differenza nel traffico della barr2-GFP (15 min): b2AR : rimaneva nella membrana plasmatica (A) V2R : nell’arco di 2-3 min, finisce nellevescicole endocitotiche (B) adren vasopr Cellule HEK-293 Co-transfettate con barr2-GFP e ciascun recettore Pre-marcate con rodamina-conj. Anticorpo che marca I recettori trattate per 15 min a 37C con l’agonista (10M Isoproterenol, 100nM AVP) visualizzazione al confocale del recettore (rosso) e della barr2-GFP (verde) nelle stesse cellule. Colocalizzazione (giallo) del recettore con la barr2-GFP Colocalizzazione della barr2-GFP con i Recettori b2AR e V2R internalizzati I recettori b2AR e V2R reclutano barrestin con un meccanismo comune durante le fasi iniziali, ma poi c’è divergenza. Il complesso barrestin- b2AR si dissocia a livello della membrana. barrestin-V2AR viene intenalizzato in vescicole endocitotiche. V2R : estesa colocalizzazione b2AR : nessuna colocalizzazione Recettori accoppiati a proteine G Il neurotrasmettitore o l’ormone si lega al recettore Quanto veloce? da 100 ms a 10 s Quanto lontano? probabilmente <1 m Attiva una G proteina Effettore: enzima o canale esterno interno b g a a GDP + Pi Risposta GTP b g